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RNA干扰介导的FANCF基因沉默增加肺癌细胞对顺铂的敏感性

作　者: 戴春华
导　师: 李坚
学　校: 江苏大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 肺癌细胞 顺铂 FA/BRCA途径 基因沉默 耐药 FANCF FANCD2 单泛素化 小干扰RNA 转染
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


目的：FA/BRCA途径被激活的标志事件是FANCD2的单泛素化。研究已经显示FA/BRCA途径的DNA损伤修复功能在肿瘤细胞对DNA交联剂类药物(如顺铂,DDP)的耐药中发挥了作用,但是该途径参与肺癌细胞对DDP耐药的确切机制尚未阐明,抑制FA/BRCA途径功能是否能增加肺癌细胞对DDP的敏感性未见报道。为此本研究目的如下：(1)通过对DDP处理后的肺癌细胞A549和SK-MES-1的细胞增殖率变化及FANCC、FANCF、FANCL mRNA和蛋白表达水平变化,研究FANCC、FANCF、 FANCL蛋白参与肺癌细胞对DDP耐药的可能性及程度,探寻肺癌细胞FA/BRCA途径与DDP耐药相关的主要或关键蛋白。(2)应用siRNA转染技术沉默肺癌细胞A549和A549/DDP(耐DDP细胞株)FA/BRCA途径中的FANCF基因,探讨FANCF基因抑制后逆转肺癌细胞对DDP耐药的效应及可行性,以及FANCF基因沉默和FANCD2(L/S)单泛素化程度的关系,确定FANCF在FA/BRCA途径DNA损伤修复功能中的关键作用,探讨FA/BRCA途径参与肺癌细胞对DDP耐药的作用机制,确定FANCF是否有望成为降低或逆转肺癌细胞对DDP耐药的新型靶基因。方法：(1)体外培养肺癌细胞株A549和SK-MES-1,采用CCK-8法分别测定经不同浓度DDP处理这二个肺癌细胞株后24h和48h的细胞增殖率。(2)采用实时荧光定量RT-PCR技术(QRT-PCR)和Western blotting检测肺癌细胞株中的FANCC、FANCF、FANCL mRNA和相应蛋白表达。(3)合成针对FANCF和FANCD2基因的siRNA,用阳离子脂质体转染法分别转染于肺癌细胞株A549A和549/DDP,获得FANCF和FANCD2基因沉默的六组A549和A549/DDP细胞(包括FANCF基因和FANCD2基因分别沉默,及FANCF和FANCD2基因共沉默)。(4)采用CCK-8法分别测定经不同浓度DDP处理上述六组肺癌细胞株(A549和A549/DDP)后24h和48h的细胞增殖率。(5)采用Western blotting法检测经不同浓度DDP处理上述六组肺癌细胞株(A549和A549/DDP)后24h和48h的FANCF、FANCD2蛋白表达水平及FANCD2单泛素化水平(以FANCD2-L/FANCD2-S比值表示,L/S)。(6)采用流式细胞仪测定不同浓度DDP处理肺癌细胞A549/DDP(包括FANCF基因和FANCD2基因分别沉默,及FANCF和FANCD2基因共沉默共3组)的细胞凋亡率。(7)采用免疫荧光法测定FANCF和FANCD2基因沉默前后经DDP处理的肺癌细胞株FANCD2核聚小体表达的变化。结果：(1)肺癌细胞A549和SK-MES-1的细胞增殖率均随DDP浓度增加和作用时间延长而逐渐降低,呈剂量依赖性(P<0.05)和时间依赖性(P<0.05)。经DDP处理后肺癌细胞A549增殖率低于SK-MES-1细胞；肺癌细胞A549的FANCC、 FANCF和FANCL蛋白表达水平随DDP浓度增高呈进行性降低。肺癌细胞SK-MES-1的]FANCC、FANCF蛋白表达水平在DDP浓度5-20μg/ml范围内较对照组明显地增高。(2)不同浓度梯度的DDP处理已转染FANCF-siRNA的A549细胞后,细胞增殖率随DDP浓度的增加而减低,呈剂量依赖性(P<0.05)。随DDP作用时间的延长,各个DDP浓度组细胞增殖率逐渐下降,呈时间依赖性(P<0.05)。不同浓度DDP处理转染FANCD2-siRNA的A549细胞增殖率曲线的变化和FANCD2-siRNA与FANCF-siRNA共转染的A549细胞相一致。不同浓度DDP处理已转染FANCF-siRNA的A549/DDP细胞后,细胞增殖率在24小时组随DDP浓度的增加无明显变化,五个浓度组之间两两比较均无有统计学意义。不同浓度DDP分别处理转染FANCD2-siRNA的A549/DDP细胞和同时共转染FANCD2-siRNA和FANCF-siRNA的A549/DDP细胞后,细胞增殖率曲线随DDP浓度的增加而减低,呈剂量依赖性(P<0.05)和时间依赖性(P<0.05)。(3)转染FANCF-siRNA的A549细胞经不同浓度DDP处理24H后FANCF和FANCD2蛋白表达水平下降,且随着DDP浓度的增高,依次降低,各DDP浓度组与对照组比较FANCF和FANCD2水平均显著降低(P<0.05)；而且转染FANCF-siRNA的A549细胞经DDP处理24小时后的FANCD2单泛素化水平(L/S比值)随着DDP浓度的增高,逐渐降低,各DDP浓度组与对照组比较呈显著降低(P<0.05)。转染FANCD2siRNA的A549细胞和同时共转染FANCD2-siRNA和FANCF-siRNA的A549细胞经不同浓度DDP处理24H后,FANCD2蛋白表达水平下降,且随着DDP浓度的增高,依次降低,各DDP浓度组与对照组比较FANCD2水平显著降低(P<0.05),而且二组肺癌细胞经DDP处理24小时后FANCD2单泛素化水平(L/S比值),随着DDP浓度的增高,依次降低,转染后各DDP浓度组与对照组比较显著降低(P<0.05)。转染FANCF-siRNA的A549/DDP细胞经不同浓度DDP处理24小时后,FANCF和FANCD2蛋白表达水平降低,各DDP浓度组与对照组比较FANCF和FANCD2水平显著降低(P<0.05),利用双变量相关分析显示FANCF和FANCD2蛋白水平变化呈正相关(相关系数r=0.90,v=4,0.01<P<0.02)；各DDP浓度组FANCD2单泛素化水平(L/S)与对照组比较显著降低(P<0.05)。转染FANCD2-siRNA的A549/DDP细胞和共转染FANCD2-siRNA和FANCF-siRNA的A549/DDP细胞经不同浓度DDP处理24小时后,二组细胞FANCD2蛋白表达水平均下降,且随着DDP浓度的增高,依次降低,与对照组比较FANCD2水平有统计学意义(P<0.05),各DDP浓度组FANCD2单泛素化水平(L/S)与对照组比较显著降低(P<0.05)。(4)不同浓度DDP处理分别单独转染FANCF-siRNA和FANCD2-siRNA,及共转染FANCF-siRNA与FANCD2-siRNA的A549/DDP细胞24小时后,细胞凋亡率随DDP浓度的增加而增加,呈剂量依赖性,与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05)。转染FANCD2-siRNA的A549/DDP细胞,各DDP浓度组细胞凋亡率明显高于转染FANCF-siRNA的A549/DDP细胞(P<0.05)。共转染FANCF-siRNA与FANCD2-siRNA的A549/DDP细胞,各DDP浓度组细胞凋亡率明显高于单独转染FANCF-siRNA和单独转染FANCD2-siRNA的A549/DDP细胞(P<0.05)。(5)采用免疫荧光法分别检测FANCF和FANCD2基因沉默前后的肺癌细胞株A549、A549/DDP经DDP处理后胞核内FANCD2核聚小体表达显示,无论是单独转染FANCF-siRNA和FANCD2-siRNA,或共转染FANCF-siRNA与FANCD2-siRNA的A549及549/DDP细胞,胞核内FANCD2核聚小体表达均明显少于转染前。结论：(1)肺癌细胞SK-MES-1对DDP的耐药性高于肺癌细胞A549。肺癌细胞SK-MES-1对DDP耐药性增高的机制之一可能是FA/BRCA途径中FANCF和FANCC蛋白高表达的结果,FA/BRCA途径的DNA损伤修复功能在肺癌细胞对DDP耐药中发挥了一定的作用。(2)应用siRNA转染技术沉默肺癌细胞FA/BRCA途径中的FANCF基因,可明显下调FANCD2单泛素化水平和FANCD2核聚小体表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,从而增加肺癌细胞对DDP的敏感性。因此FANCF作为FA核心复合体中的衔接蛋白,是维持FA/BRCA通路功能的重要因子,参与了FA复合体的稳定及对FANCD2单泛素化激活等FA/BRCA途径功能调控的关键步骤,是激活FANCD2单泛素化的关键基因,对肺癌细胞的增值和凋亡及其在对DDP耐药机制中有着重要作用。(3)应用siRNA转染技术沉默DDP耐药肺癌细胞A549/DDP的FANCF基因亦可增加对DDP的敏感性,如共沉默FANCF和FANCD2基因可进一步增加对DDP的敏感性,即增加对DDP耐药性的逆转程度。因此,我们的研究表明沉默肺癌细胞的FANCF基因,能明显降低FANCD2单泛素化水平,可抑制或阻断FA/BRCA途径的DNA损伤修复功能,使DDP引起的DNA链间交联性损伤不能有效修复,进而抑制细胞增殖,增加细胞凋亡,表现细胞对DDP敏感性增加,从而至少部分逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性。所以FANCF有望成为降低或逆转肺癌细胞对DDP耐药的新型靶基因。

全文目录


摘要  6-10
ABSTRACT  10-19
第一章 绪论  19-30
  1.1 前言  19-23
  1.2 本论文研究的目的、方法、实验方案和意义  23-30
    1.2.1 研究目的  23-24
    1.2.2 研究的主要内容和方法  24-26
    1.2.3 实验方案的设计  26-29
    1.2.4 研究意义  29-30
第二章 顺铂对肺癌细胞FA/BRCA途径相关基因表达的作用  30-67
  2.1 主要仪器和试剂  30-34
    2.1.1 主要仪器  30-31
    2.1.2 主要试剂  31-32
    2.1.3 主要试剂配制  32-34
  2.2. 顺铂对肺癌细胞株(A549、SK-MES-1)细胞增殖率的作用  34-40
    2.2.1 细胞株  34-35
    2.2.2 实验步骤  35-38
    2.2.3 结果  38-40
  2.3 顺铂对肺癌细胞株FANCC、FANCF和FANCL mRNA表达水平的作用  40-61
    2.3.1 细胞株  41
    2.3.2 标本处理与收集  41
    2.3.3 实验步骤  41-44
    2.3.4 结果  44-61
  2.4. 不同浓度梯度顺铂对肺癌细胞FANCC、FANCF和FANCL蛋白表达水平的作用  61-67
    2.4.1. 细胞株  61
    2.4.2 标本处理与收集  61
    2.4.3 实验步骤  61-64
    2.4.4 结果  64-67
第三章 肺癌细胞FANCF基因沉默对顺铂敏感性的作用  67-107
  3.1 主要仪器和试剂  68
  3.2 细胞转染  68-69
    3.2.1 细胞株  68
    3.2.2 实验步骤  68-69
  3.3 目的基因转染效率的筛选：RT-PCR法  69-75
    3.3.1 标本处理  69-70
    3.3.2 标本收集  70
    3.3.3 实验步骤  70-71
    3.3.4 结果  71-75
  3.4 DDP对FANCF和FANCD2基因沉默肺癌细胞株细胞增殖率的作用  75-85
    3.4.1. 细胞株  75
    3.4.2 实验步骤  75-76
    3.4.3 结果  76-85
  3.5 DDP对FANCF和FANCD2基因沉默肺癌细胞株FANCF和FANCD2蛋白表达水平的作用  85-97
    3.5.1. 细胞株  85
    3.5.2 标本处理与收集  85
    3.5.3. 实验步骤  85-86
    3.5.4 结果  86-97
  3.6 不同浓度DDP对FANCF和FANCD2基因沉默的肺癌细胞株A549/DDP细胞凋亡率的作用  97-104
    3.6.1. 细胞株  97
    3.6.2 实验步骤  97-98
    3.6.3 统计方法  98
    3.6.4 结果  98-104
  3.7 免疫荧光法检测DDP对FANCF和FANCD2基因沉默的肺癌细胞株FANCD2单泛素化的作用  104-107
第四章 讨论  107-117
参考文献  117-123
综述  123-131
  参考文献  127-131
致谢  131-132
攻读博士学位期间发表的文章  132

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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