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小麦黄花叶病毒（WYMV）RNA2编码基因的功能研究

作　者: 向荣
导　师: 陈剑平；孙丽英
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 小麦黄花叶病毒 原核表达 基因基因沉默抑制子 病毒致病性因子 亚细胞定位 蛋白互作
分类号: S435.121
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


近年来,在我国冬小麦主要产区,由禾谷多黏菌传播的小麦黄花叶病日益严重。该病由小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)引起。WYMV属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,其基因组由两条单链正义RNA组成,其中RNA1编码的蛋白有：P3、7K、CI、14K、Nla-VPg、NIb-VPg和CP, RNA2编码P1和P2蛋白,与已知马铃薯Y病毒属成员编码的HC-Pro具有相似的结构域。HC-Pro是研究最深入的病程蛋白之一,在病毒的复制、运输、移动、RNA沉默抑制和病毒致病性等方面有着重要的功能。本研究对WYMV P1和P2与马铃薯Y病毒属成员HC-Pro的功能进行了对比研究。通过对WYMV P1抗血清免疫分析,明确P1抗血清不与WYMV粒子反应,表明P1不直接参与病毒粒子的包装；利用农杆菌共浸润实验,明确WYMV P1和P2没有抑制同源基因诱导的RNA沉默；通过将WYMV P1, WYMV P2的N端P2N以及P1和P2N的复合蛋白P1P2N分别克隆到马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)侵染性克隆,摩擦接种本氏烟,结果表明WYMV P1和P2N对PVX症状的表达影响不大,而P1P2N能够轻微加重PVX的在本氏烟上的症状,HC-Pro(PVY)明显加重了PVX的症状；利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在植物和昆虫细胞表达体系中研究表明WYMV P1可以进行自我互作,也与WYMV VPg特异性互作；通过亚细胞定位分析WYMV P1、VPg分别单独表达和一起表达时在细胞中的分布,发现P1可以改变VPg在亚细胞中的分布。根据上述研究结果,我们推测WYMV P1功能与马铃薯Y病毒属成员HC-Pro的功能特性有所不同,并发现WYMVP1可能通过调节VPg亚细胞分布,协助VPg而实现其功能。

全文目录


摘要  5-6ABSTRACT  6-8目录  8-11缩写中英文对照  11-12文献综述  12-22  1.1 小麦黄花叶病  12-14    1.1.1 病害分布、症状、危害与防治  12-13    1.1.2 病害侵染循环  13-14  1.2 小麦黄花叶病毒(WYMV)分子生物学研究  14-17    1.2.1 基因组结构  14-15    1.2.2 WYMV编码主要蛋白的功能  15-17      1.2.2.1 P1蛋白  15-16      1.2.2.2 P2蛋白  16      1.2.2.3 VPg  16      1.2.2.4 HC-Pro  16-17  1.3 研究WYMV RNA2功能所采用实验技术  17-21    1.3.1 基因沉默  17-19      1.3.1.1 植物中基因沉默的病毒抑制  17-18      1.3.1.2 农杆菌介导转化  18-19      1.3.1.3 农杆菌共浸润的瞬时表达  19    1.3.2 BiFC及荧光定位  19-21      1.3.2.1 BiFC的原理  19-20      1.3.2.2 BiFC的操作方法  20-21      1.3.2.3 BiFC的研究应用  21  1.4 研究目的和意义  21-22第二章 材料与方法  22-34  2.1 实验材料  22-23    2.1.1 植物材料  22    2.1.2 菌种和载体  22    2.1.3 试剂和仪器  22-23      2.1.3.1 试剂  22      2.1.3.2 仪器  22-23  2.2 实验方法  23-34    2.2.1 ELISA检测  23-24      2.2.1.1 试剂及缓冲液  23      2.2.1.2 间接ELISA  23-24    2.2.2 植物总RNA的提取  24    2.2.3 RT-PCR  24-25    2.2.4 PCR产物纯化  25-26    2.2.5 连接反应  26    2.2.6 感受态细胞制备  26-27      2.2.6.1 大肠杆菌感受态细胞制备(CaCl_2法)  26-27      2.2.6.2 电转化感受态细胞制备  27    2.2.7 转化  27-28      2.2.7.1 热激转化  27      2.2.7.2 电转化  27-28    2.2.8 乙醇沉淀  28    2.2.9 阳性克隆的筛选和鉴定  28    2.2.10 质粒DNA少量提取  28-29    2.2.11 BD载体质粒提取  29    2.2.12 重组质粒的鉴定  29-30    2.2.13 酶切  30    2.2.14 载体末端去磷酸化  30    2.2.15 融合蛋白的诱导表达及检测  30-31    2.2.16 目的蛋白纯化和回收  31    2.2.17 Western-blotting  31-34      2.2.17.1 SDS-PAGE  31-32      2.2.17.2 Western-blotting检测  32-34第三章 原核表达WYMV P1融合蛋白制备抗血清及检测  34-40  3.1 材料与方法  34-35    3.1.1 实验材料  34    3.1.2 WYMV P1蛋白基因克隆与序列分析  34-35    3.1.3 原核表达质粒构建  35    3.1.4 WYMV-P1融合蛋白诱导表达及检测  35    3.1.5 目的蛋白纯化与回收  35    3.1.6 P1蛋白抗血清制备及检测  35  3.2 结果与分析  35-39    3.2.1 WYMV P1基因克隆与序列分析  35-36    3.2.2 原核表达质粒构建  36-37    3.2.3 pGEX 6P-1-P1融合蛋白的诱导表达及检测  37    3.214 目的蛋白回收与纯化  37-38    3.2.5 抗血清制备  38-39    3.2.6 P1蛋白的血清学检测  39  3.3 讨论  39-40第四章 小麦黄花叶病毒RNA2沉默抑制的研究  40-47  4.1 材料与方法  40-43    4.1.1 材料  40      4.1.1.1 植物材料  40      4.1.1.2 质粒和菌株  40    4.1.2 方法  40-43      4.1.2.1 WYMV RNA2基因克隆  40-41      4.1.2.2 重组质粒构建  41-42      4.1.2.3 重组质粒转入农杆菌  42      4.1.2.4 农杆菌浸润烟草  42-43  4.2 结果与分析  43-45    4.2.1 WYMV RNA2基因克隆  43    4.2.2 重组质粒构建  43-44    4.2.3 WYMV RNA2编码基因沉默抑制子能力的鉴定  44-45  4.3 讨论  45-47第五章 WYMV RNA2部分蛋白对PVX症状的影响  47-53  5.1 材料与方法  47-49    5.1.1 实验材料  47    5.1.2 实验方法  47-49      5.1.2.1 重组表达载体的构建  47-48      5.1.2.2 农杆菌介导pGR106的侵染体系  48-49  5.2 结果与分析  49-51    5.2.1 重组表达载体的构建  49-50    5.2.2. 嵌合体病毒接种烟草后症状表达  50-51  5.3 讨论  51-53第六章 WYMV P1蛋白在昆虫及植物细胞内的荧光定位  53-64  6.1 材料与方法  53-55    6.1.1 载体与菌种  53    6.1.2 主要试剂  53    6.1.3 方法  53-55      6.1.3.1 重组质粒的构建  53-54      6.1.3.2 重组穿梭质粒的构建  54-55      6.1.3.3 昆虫细胞的转染及共杆菌介导的转染  55      6.1.3.4 共聚焦显微镜观察  55  6.2 结果与分析  55-62    6.2.1 重组质粒的构建和鉴定  56    6.2.2 昆虫细胞中定位  56-59      6.2.2.1 P1蛋白的荧光定位  57      6.2.2.2 P1蛋白的自我互作  57-58      6.2.2.3 P1蛋白与WYMV RNA1编码的其他蛋白互作  58-59    6.2.3 烟草细胞中荧光定位  59-62      6.2.3.1 P1蛋白的荧光定位  59      6.2.3.2 VPg蛋白的荧光定位  59-60      6.2.3.3 P1蛋白的自我互作  60      6.2.3.4 P1蛋白与VPg蛋白的互作  60-61      6.2.3.5 WYMV-P1蛋白与WYMV-VPg植物细胞内共表达  61-62  6.3 讨论  62-64第七章 结论与展望  64-66  7.1 结论  64  7.2 展望  64-66参考文献  66-73附录  73-77在读期间发表的学术论文  77-78致谢  78-79

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 麦类病虫害 > 病害
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