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姜黄素逆转肺癌细胞对顺铂耐药性的FA/BRCA途径机制研究

作　者: 陈萍
导　师: 李坚
学　校: 江苏大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 肺癌细胞 顺铂 FA/BRCA途径 姜黄素 药物耐药 单泛素化 FANCD2 细胞增殖 凋亡
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


背景和目的：研究已经证明FA/BRCA途径是修复细胞DNA交联损伤的重要组成部分,该途径的功能状态与细胞对致交联损伤药物如顺铂(DDP)的敏感性相关,正常的FA/BRCA途径被激活是细胞对DNA链间交联剂(DDP等)耐药的分子基础。但是肺癌细胞对DDP耐药现象与FA/BRCA途径功能状态的关系还不很清楚,迄今为止FA/BRCA途径在肺癌细胞对DDP耐药中的作用机制尚无研究报道,FA/BRCA途径抑制剂姜黄素是否可逆转DDP耐药肺癌细胞对DDP的耐药性亦未见文献报告。因此,本研究以体外培养肺癌细胞株为研究对象,通过检测对DDP具有不同敏感性的肺癌细胞株FA/BRCA途径相关基因FANCC、FANCF、 FANCL、FANCD2mRNA及蛋白表达和FANCD2单泛素化状态,探讨FA/BRCA途径参与肺癌细胞对交联剂DDP耐药的分子机制。通过应用姜黄素和DDP处理DDP耐药肺癌细胞,观察FA/BRCA途径功能状态和肺癌细胞对DDP敏感性的变化,研究FA/BRCA途径抑制剂姜黄素增加肺癌细胞对DDP敏感性的作用机制,探讨姜黄素作为DDP耐药逆转剂用于肺癌治疗的可行性。方法：1、体外培养肺癌细胞株A549、Calu-1,应用CCK-8法检测经不同浓度DDP处理后肺癌细胞株A549和Calu-1的细胞增殖抑制率,观察比较不同肺癌细胞株对DDP敏感性的差异。实时荧光定量RT-PCR法分别测定用不同浓度DDP处理前后A549、Calu-1的FANCC、FANCF、FANCL和FANCD2mRNA表达水平的变化,Western blotting法分别测定不同浓度DDP处理后A549、Calu-1细胞株FANCC、FANCF、FANCL和FANCD2蛋白的表达,测定以FANCD2-L和FANCD2-S比值所表示的FANCD2单泛素化程度。探讨FA/BRCA途径在肺癌细胞对DDP耐药中的作用机制。2、体外培养DDP敏感肺癌细胞株A549和耐药肺癌细胞株A549/DDP,分别用不同浓度的姜黄素、DDP及姜黄素加DDP处理后,Western blotting法测定这两个肺癌细胞的FANCD2单泛素化程度,免疫荧光染色法观察胞核内FANCD2核聚小体的形成,CCK-8法测定细胞增殖抑制率,DAPI荧光染色检测细胞凋亡,Annexin V/PI流式细胞术测定细胞凋亡率。观察姜黄素、DDP及姜黄素加DDP分别对肺癌细胞的细胞增殖和凋亡的作用,以及与FA/BRCA途径激活状态之间的关系,探讨姜黄素增加耐DDP肺癌细胞对DDP敏感性的效应,以及其这一效应的FA/BRCA途径机制。结果：1、DDP对肺癌细胞A549、Calu-1的增殖抑制作用均呈剂量依赖性和时间依赖性关系。经过不同浓度DDP处理24H和48H后,细胞A549的IC50明显低于细胞Calu-1,表明细胞A549对DDP的敏感性高于细胞Calu-1,细胞Calu-1对DDP相对耐药。与此相对应的是,肺癌细胞A549的FANCF和FANCL mRNA的表达(主要在DDP浓度2.5-5μg/ml时和20μg/ml)低于细胞Calu-1, A549细胞FANCD2mRNA的表达在DDP处理24H有所增高,但在DDP处理48H后明显降低,而Calu-1细胞FANCD2mRNA的表达在DDP处理24H(除DDP浓度20μg/ml外)和48H后均明显升高(除DDP浓度20μg/ml外)。肺癌细胞A549中的FANCF. FANCL和]FANCD2蛋白表达水平随DDP浓度增高呈进行性降低,而肺癌细胞Calu-1的FANCF蛋白(在2.5-10μg/ml DDP浓度范围内)表达随DDP作用时间的延长和浓度的逐渐上升呈进行性增高。Calu-1细胞的FANCD2单泛素化程度明显高于A549细胞。2. A549/DDP细胞株对DDP中度耐药。分别用不同浓度的姜黄素、DDP及姜黄素加DDP处理后,A549/DDP细胞FANCD2单泛素化程度明显高于A549细胞。当用姜黄素联合DDP处理A549/DDP细胞时,姜黄素的加入显著降低A549/DDP细胞的FANCD2单泛素化水平,且联合用药组的FANCD2单泛素化水平在0-20μg/ml DDP浓度范围内均低于单独用药组,显示出明显的抑制效应。当姜黄素和不同浓度DDP联合分别处理两个肺癌细胞时,A549/DDP细胞核聚小体的表达较A549细胞明显减弱,表明姜黄素能抑制以FANCD2单泛素化及核聚小体形成为激活特征的FA/BRCA途径功能,逆转肺癌细胞对DDP的耐药性。姜黄素联合DDP处理时A549细胞增殖抑制率均高于两药单用时的增殖抑制率,但并未观察到两个药物之间的协同作用,q值<1.15。姜黄素联合DDP处理时A549/DDP的细胞增殖抑制率亦高于两药单用时的增殖抑制率,但姜黄素和DDP显示出明显的协同效应,q值>1.15。姜黄素和DDP联用时DDP抑制A549/DDP细胞的IC50显著下降,逆转倍数显著增高,表明细胞对DDP的敏感性增加。同时DAPI法显示A549/DDP细胞经姜黄素联合DDP处理时,细胞核染色质固缩明显,形成很多颗粒物质,核内染色质由于浓集而呈亮蓝色,细胞核破裂形成碎片,核解体,可见凋亡小体。应用Annexin V/PI双染法结合流式细胞仪检测细胞凋亡率发现,单用姜黄素或DDP分别处理A549和A549/DDP细胞48H后,A549细胞凋亡率明显高于A549/DDP细胞。而与之相反的是,用姜黄素联合DDP处理A549/DDP细胞后,细胞凋亡率在DDP浓度10-20μg/ml范围明显高于A549细胞。表明姜黄素与DDP共同作用时,DDP介导的FA/BRCA途径DNA损伤修复功能的激活受到姜黄素抑制,从而增强DDP诱导耐药肺癌细胞A549/DDP凋亡的作用。结论：1、FA/BRCA途径参与了肺癌细胞对DDP的耐药机制,其中蛋白FANCF、 FANCD2在肺癌Calu-1细胞对DDP的耐药中可能起了较大作用,FANCD2单泛素化程度与肺癌细胞对DDP的耐药性相关,DDP处理肺癌细胞后的FANCD2单泛素化状态有可能作为预测肺癌患者是否对铂类药物化疗敏感的候选指标。2、姜黄素可抑制DDP耐药肺癌细胞株A549/DDP细胞的FANCD2单泛素化,减少核聚小体形成,增强DDP对耐药肺癌细胞的增殖抑制作用,并在诱导肺癌细胞凋亡时与DDP有协同作用,进而逆转了DDP耐药肺癌细胞对DDP的耐药性。因此我们的实验结果证明,姜黄素作为FA/BRCA途径抑制剂,可抑制肺癌细胞FA/BRCA途径的DNA损伤修复功能,逆转肺癌细胞对DDP的耐药性,有望在今后成为肺癌临床治疗中的重要成员。

全文目录


摘要  6-9
ABSTRACT  9-16
第一章 绪论  16-25
  1.1 研究背景  16-20
  1.2 研究目的、内容、实验方案和意义  20-25
    1.2.1 研究目的  20
    1.2.2 研究内容、方法  20-22
    1.2.3 实验方案  22-24
    1.2.4 研究的意义  24-25
第二章 肺癌细胞顺铂耐药的FA/BRCA途径研究  25-61
  2.1 实验材料  25
  2.2 实验方法  25-40
    2.2.1 细胞培养  25-29
    2.2.2 CCK-8法测定细胞增殖抑制率  29-31
    2.2.3 荧光定量RT-PCR检测FANCC、F、L和FANCD2 mRNA表达水平  31-35
    2.2.4 Western Bloting测定FANCC、F、L和FANCD2蛋白表达水平  35-40
  2.3 结果  40-61
    2.3.1 DDP对肺癌细胞A549、Calu-1的增殖抑制作用  40-46
    2.3.2 DDP对FANCC、F、L和FANCD2 mRNA表达水平的作用  46-54
    2.3.3 DDP对肺癌细胞FANCC、F、L和FANCD2蛋白表达水平的作用  54-58
    2.3.4 DDP对肺癌细胞A549和Calu-1 FANCD2单泛素化的作用  58-61
第三章 姜黄素逆转肺癌细胞对DDP耐药的FA/BRCA途径机制研究  61-119
  3.1 实验材料  61-62
  3.2 实验方法  62-80
    3.2.1 细胞培养  62-64
    3.2.2 CCK-8法测定细胞增殖抑制率计算IC50  64-66
    3.2.3 CCK-8法测定细胞增殖抑制率  66-68
    3.2.4 Western blotting检测肺癌细胞FANCD2单泛素化  68-72
    3.2.5 免疫荧光染色法检测肺癌细胞核聚小体形成  72-75
    3.2.6 DAPI荧光染色法观察肺癌细胞形态学变化  75-77
    3.2.7 Annexin V/PI法流式细胞术检测肺癌细胞凋亡  77-80
  3.3 结果  80-119
    3.3.1 细胞形态学观察  80
    3.3.2 A549/DDP细胞的耐药性  80-84
    3.3.3 姜黄素联合DDP对A549和A549/DDP细胞增殖的抑制活性  84-97
    3.3.4 姜黄素和DDP对A549和A549/DDP肺癌细胞FANCD2单泛素化的作用  97-102
    3.3.5 姜黄素对A549、A549/DDP肺癌细胞核聚小体形成的作用  102-104
    3.3.6 荧光染色法观察姜黄素诱导A549、A549/DDP肺癌细胞凋亡  104-106
    3.3.7 Annexin V/PI双染流式细胞术检测姜黄素促进A549、A549/DDP肺癌细胞凋亡的作用  106-119
第四章 讨论  119-135
结论与展望  135-136
参考文献  136-147
综述  147-158
  参考文献  154-158
致谢  158-159
攻读博士学位期间发表的文章  159

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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