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转染TFPI-2重组质粒对肺癌细胞NCI-H460的影响

作　者: 王晓明
导　师: 王衍富
学　校: 大连医科大学
专　业: 老年医学
关键词: TFPI-2 NSCLC NCI-H460细胞 转染
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


背景:肺癌在全世界范围内的发病率和病死率居恶性肿瘤之首,严重影响着人类的生命健康,其中非小细胞肺癌(non small cell lung cancer ,NSCLC)占80%左右,因其恶性程度高,转移速度快,5年生存率只有25%～30%且约3/4的NSCLC患者在初诊时即已发生转移,给临床治疗增加了难度。分子生物学研究表明,肺癌的发生是一个多因素共同参与、多阶段的复杂生物学过程,与癌基因激活、抑癌基因失活密切相关。因为NSCLC的现阶段临床治疗局限于化疗、放疗及手术,基因治疗尚处在科研开发阶段,故探索NSCLC发病的分子机制及新的干预靶点,具有重要的临床意义。目前研究显示,人类组织因子途径抑制因子-2(Tissue Factor Pathway Inhibitor-2, TFPI-2)是一种抑癌基因,在恶性程度比较高的肿瘤细胞中普遍呈低表达状态,而在恶性程度比较低的肿瘤细胞中其表达量相对较高。Sajani S等人对TFPI-2在人类肺部肿瘤的侵袭与转移中所起的作用进行了大量研究,其研究结果证实在肺部肿瘤细胞中,TFPI-2的低水平表达可大大增强肿瘤细胞A549的存活能力及生长速度,并且与肺部肿瘤的侵袭与转移有一定关系。因此本实验着手于研究TFPI-2在NSCLC细胞NCI-H460中的表达状况,并且采用基因转染的方法,提高NCI-H460中TFPI-2的表达水平,从而降低肿瘤细胞的生长速度,减少肿瘤转移的几率。目的:观察基因转染后的肿瘤细胞形态学变化,检测基因转染前后TFPI-2在NSCLC细胞NCI-H460中的表达情况,综合分析TFPI-2在肺部恶性肿瘤发生中的作用,为肺癌的临床治疗提供新的理论依据。方法:通过脂质体(LipofectamineTM 2000)将人类TFPI-2重组质粒转染人大细胞肺癌细胞NCI-H460,以此提升NCI-H460细胞中TFPI-2的表达,使用荧光显微镜检测转染效率,观察转染后NCI-H460细胞的形态学变化,采用RT-Real Time PCR及免疫荧光、Western blot等技术从RNA水平以及蛋白水平检测转染后NCI-H460细胞中TFPI-2的表达情况,应用流式细胞技术检测转染后NCI-H460细胞的凋亡和周期变化。结果:1.转染率荧光显微镜下见转染率达98%以上。2. RT-Real Time PCR结果与空白组及阴性组相比,实验组中TFPI-2 RNA表达水平提高,并且随着PCR循环次数的增多,TFPI-2 CDNA浓度明显增高。运用重复测量资料的方差分析,实验组与空白组及阴性对照组之间比较均有差异(P<0.05),而空白组与阴性组经统计学分析无明显差异(P>0.05)。3.免疫荧光及Western blot检测蛋白表达荧光显微镜下,与空白组及阴性对照组相比,实验组中TFPI-2蛋白表达水平有较大程度提高。Western blot检测出,转染后的NCI-H460细胞内TFPI-2蛋白表达水平提高一倍左右,经labworks软件分析系统鉴定TFPI-2/β-actin吸光度比值结果,实验组与空白组及阴性对照组之间差异比较均有统计学意义(P<0.05),而空白组与阴性组经统计学分析无明显差异(P>0.05)。4.流式细胞技术检测结果4.1细胞周期阻滞检测结果显示,转染48-72小时后,实验组细胞明显被阻滞于G1/S期,而空白组与阴性对照组成正常生长趋势分布。4.2细胞凋亡检测结果显示,转染48-72小时后,实验组凋亡率为(24.28±0.33)%,而空白组为(4.83±0.17)%,阴性对照组为(4.85±0.21)%。运用重复测量资料的方差分析,实验组与空白组及阴性对照组之间差异比较均有统计学意义(P<0.05),而空白组与阴性组经统计学分析无明显差异(P>0.05)。结论:提高NCI-H460细胞内TFPI-2表达水平,可减缓NSCLC细胞的增殖,促进细胞凋亡。

全文目录


摘要  6-8Abstract  8-11前言  11-12材料和方法  12-19  一、主要实验材料  12  二、实验方法  12-19结果  19-22  1. NCI-H460 细胞形态学观察  19  2. 荧光显微镜检测转染效率  19-20  3. TFPI-2 mRNA 水平检测  20-21  4. 免疫荧光检测转染后蛋白表达  21  5. Western blot 检测转染后 TFPI-2 蛋白水平变化  21-22  6. 流式细胞技术检测转染后 NCI-H460 细胞的凋亡和周期变化  22讨论  22-26结论  26-27参考文献  27-30综述  30-40  参考文献  36-40致谢  40

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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