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慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究
作 者: 邹晓龙
导 师: 刘红林
学 校: 南京农业大学
专 业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: RNA干扰 短发夹RNA 慢病毒载体 肌肉生长抑制素 基因沉默
分类号: S828
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
Myostatin (MSTN)是肌肉生长抑制素,又称GDF-8,属于TGF-β超家族成员。该基因已被证明是是肌肉生长的负调控因子。自发突变或遗传操作(敲除或下调)造成的MSTN失活,已经被报道可以增加许多种动物的骨骼肌数量。RNA干扰(RNAi)是dsRNA介导的一种序列特异性的转录后基因沉默(PTGS)现象。RNAi技术的出现为研究基因功能提供了一种快速而有效的基因敲除方法。病毒载体已经被开发用于在哺乳动物细胞中递送siRNA,其中利用慢病毒载体表达shRNA则是获得稳定RNA干扰的非常有效的办法。靶向1myostatin的RNA干扰策略将可能用于增加动物的骨骼肌数量。因此,本研究拟探索用慢病毒载体表达shRNA沉默猪胎儿成纤维细胞中myostatin基因的可行性,为深入研究myostatin在猪的骨骼肌发育过程中的作用提供一些细节。通过这一策略,先用表达特异性shRNA的DNA载体瞬时转染PEF细胞,结果成功地抑制了细胞中myostatin的表达,下调效果显著(高达97%,p<0.05)。对于慢病毒载体介导的RNAi, Real-time PCR的结果显示,稳定整合了慢病毒载体的PEF细胞中myostatin被持续地抑制了,说明获得了一个稳定有效的沉默效果(达到了94%,P<0.05)。与此同时,本研究还检测了RNAi的负面效果,试验中用到的两个shRNA表达载体均没有在瞬时转染的细胞产生高水平的IFN-β和OAS2表达。但出乎意料的是,在稳定转导的PEF细胞中检测到了高水平的IFN-β和OAS2表达,分别是未转导细胞的2.49倍和14.43倍(p<0.05)。结论:本试验成功地用慢病毒载体递送shRNA到了PEF细胞中,并触发了有效而稳定的myostatin沉默,但是对于长期使用该慢病毒载体,还需要尽量降低干扰素反应水平。另外,本研究获得的表达shRNA的慢病毒颗粒可以用于制备转基因胚胎,以生产具有“双肌”表型的动物。
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全文目录
摘要 6-7ABSTRACT 7-9缩略语的中英文对照 9-10引言 10-12第一部分 文献综述 12-32 第一章 肌肉生长抑制素(Myostatin)基因的研究进展 12-20 1. 肌肉生长抑制素基因的发现过程 12-15 1.1. "双肌"(double-muscling)现象与肌肉肥大(muscular hypertrophy) 12-13 1.2. 调控组织生长发育的因子——抑制素假说(The chalone hypothesis) 13-14 1.3. Myostatin的发现 14-15 2. Myostatin基因的结构及染色体定位 15-17 2.1. Myostatin基因结构和蛋白结构 15-16 2.2. Myostatin基因的染色体定位 16-17 3. Myostatin在各组织器官的表达规律 17 4. 肌肉生长抑制素基因的应用 17-18 5. 结论 18-20 第二章 RNAi研究进展 20-32 1. RNAi的发现 20-21 2. RNAi现象的发生机制 21-24 2.1. siRNA诱导的PTGS 22-23 2.2. 内源的microRNA通路 23-24 2.3. siRNA诱导的TGS 24 3. siRNA导入方法 24-29 3.1. 非病毒载体的导入方法 25-28 3.2. 借助病毒载体导入 28-29 4. 结论 29-32第二部分 实验研究 32-60 第三章 靶向猪Myostatin基因的shRNA设计及表达载体构建 32-40 1. 材料与仪器 32-33 1.1. 菌种及试剂 32 1.2. 主要仪器 32-33 2. 实验方法 33-37 2.1. 靶向猪Myostatin基因的shRNA设计 33 2.2. DNA片段与载体片段的连接 33-34 2.3. 质粒DNA的转化 34 2.4. 质粒的快速鉴定 34-35 2.5. 质粒小量制备提取 35 2.6. DNA的胶回收 35-36 2.7. 质粒的酶切鉴定 36-37 2.8. 质粒测序及结果比对分析 37 3. 实验结果与分析 37-38 3.1. 靶向猪Myostatin基因的shRNA设计 37-38 3.2. shRNA表达载体的酶切鉴定 38 4. 讨论 38-40 第四章 shRNA沉默猪Myostatin基因的研究 40-48 1. 材料与仪器 40-41 1.1. 主要实验材料与试剂 40 1.2. 主要实验仪器 40-41 2. 实验方法 41-45 2.1. 原代猪胎儿成纤维细胞的分离与培养 41 2.2. 细胞复苏、传代与冻存 41-42 2.3. Myostatin表达载体pXF2F-MSTN的构建 42 2.4. 细胞转染 42-43 2.5. 细胞总RNA提取与反转录 43-44 2.6. Realtime PCR检测瞬时转染shRNA表达载体后PEF细胞中有关基因的表达水平 44-45 3. 实验结果与分析 45-47 3.1. shRNA表达载体的功能验证和筛选 45-46 3.2. 监测shRNA介导的干扰素反应(IFN activation) 46-47 4. 讨论 47-48 第五章 表达shRNA的慢病毒载体构建及功能验证 48-56 1. 材料与仪器 48-49 1.1. 主要实验材料与试剂 48 1.2. 主要实验仪器 48-49 2. 实验方法 49-52 2.1. 表达shRNA的慢病毒载体构建 49-50 2.2. 重组慢病毒载体的酶切鉴定 50 2.3. 测序验证及结果分析 50 2.4. 慢病毒生产与浓缩 50-51 2.5. 慢病毒转导猪胎儿成纤维细胞 51 2.6. Realtime PCR检测慢病毒载体转导后猪胎儿成纤维细胞中有关基因的表达变化 51-52 2.7. 数据处理 52 3. 实验结果 52-54 3.1. 慢病毒的shRNA表达质粒的构建结果 52 3.2. 慢病毒表达质粒的酶切鉴定结果 52-53 3.3. 慢病毒载体介导的RNAi的沉默效果 53-54 4. 讨论 54-56 第六章 shRNA慢病毒载体长期、稳定地抑制PEF中Myostatin表达的研究 56-60 1. 材料与仪器 56 1.1. 主要实验材料与试剂 56 1.2. 主要实验仪器 56 2. 实验方法 56-57 2.1. 慢病毒转导猪胎儿成纤维细胞及Blasticidin筛选稳定细胞系 56-57 2.2. Realtime PCR检测慢病毒载体转导后猪胎儿成纤维细胞中有关基因的表达变化 57 2.3. 数据处理 57 3. 实验结果 57-58 3.1. 细胞筛选结果 57-58 3.2. 稳定细胞系中的RNAi效果研究 58 4. 讨论 58-60全文结论 60-62附录一 62-64附录二 64-66参考文献 66-76致谢 76
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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