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慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究

作　者: 邹晓龙
导　师: 刘红林
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: RNA干扰 短发夹RNA 慢病毒载体 肌肉生长抑制素 基因沉默
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


Myostatin (MSTN)是肌肉生长抑制素,又称GDF-8,属于TGF-β超家族成员。该基因已被证明是是肌肉生长的负调控因子。自发突变或遗传操作(敲除或下调)造成的MSTN失活,已经被报道可以增加许多种动物的骨骼肌数量。RNA干扰(RNAi)是dsRNA介导的一种序列特异性的转录后基因沉默(PTGS)现象。RNAi技术的出现为研究基因功能提供了一种快速而有效的基因敲除方法。病毒载体已经被开发用于在哺乳动物细胞中递送siRNA,其中利用慢病毒载体表达shRNA则是获得稳定RNA干扰的非常有效的办法。靶向1myostatin的RNA干扰策略将可能用于增加动物的骨骼肌数量。因此,本研究拟探索用慢病毒载体表达shRNA沉默猪胎儿成纤维细胞中myostatin基因的可行性,为深入研究myostatin在猪的骨骼肌发育过程中的作用提供一些细节。通过这一策略,先用表达特异性shRNA的DNA载体瞬时转染PEF细胞,结果成功地抑制了细胞中myostatin的表达,下调效果显著(高达97%,p<0.05)。对于慢病毒载体介导的RNAi, Real-time PCR的结果显示,稳定整合了慢病毒载体的PEF细胞中myostatin被持续地抑制了,说明获得了一个稳定有效的沉默效果(达到了94%,P<0.05)。与此同时,本研究还检测了RNAi的负面效果,试验中用到的两个shRNA表达载体均没有在瞬时转染的细胞产生高水平的IFN-β和OAS2表达。但出乎意料的是,在稳定转导的PEF细胞中检测到了高水平的IFN-β和OAS2表达,分别是未转导细胞的2.49倍和14.43倍(p<0.05)。结论：本试验成功地用慢病毒载体递送shRNA到了PEF细胞中,并触发了有效而稳定的myostatin沉默,但是对于长期使用该慢病毒载体,还需要尽量降低干扰素反应水平。另外,本研究获得的表达shRNA的慢病毒颗粒可以用于制备转基因胚胎,以生产具有“双肌”表型的动物。

全文目录


摘要  6-7ABSTRACT  7-9缩略语的中英文对照  9-10引言  10-12第一部分 文献综述  12-32  第一章 肌肉生长抑制素(Myostatin)基因的研究进展  12-20    1. 肌肉生长抑制素基因的发现过程  12-15      1.1. "双肌"(double-muscling)现象与肌肉肥大(muscular hypertrophy)  12-13      1.2. 调控组织生长发育的因子——抑制素假说(The chalone hypothesis)  13-14      1.3. Myostatin的发现  14-15    2. Myostatin基因的结构及染色体定位  15-17      2.1. Myostatin基因结构和蛋白结构  15-16      2.2. Myostatin基因的染色体定位  16-17    3. Myostatin在各组织器官的表达规律  17    4. 肌肉生长抑制素基因的应用  17-18    5. 结论  18-20  第二章 RNAi研究进展  20-32    1. RNAi的发现  20-21    2. RNAi现象的发生机制  21-24      2.1. siRNA诱导的PTGS  22-23      2.2. 内源的microRNA通路  23-24      2.3. siRNA诱导的TGS  24    3. siRNA导入方法  24-29      3.1. 非病毒载体的导入方法  25-28      3.2. 借助病毒载体导入  28-29    4. 结论  29-32第二部分 实验研究  32-60  第三章 靶向猪Myostatin基因的shRNA设计及表达载体构建  32-40    1. 材料与仪器  32-33      1.1. 菌种及试剂  32      1.2. 主要仪器  32-33    2. 实验方法  33-37      2.1. 靶向猪Myostatin基因的shRNA设计  33      2.2. DNA片段与载体片段的连接  33-34      2.3. 质粒DNA的转化  34      2.4. 质粒的快速鉴定  34-35      2.5. 质粒小量制备提取  35      2.6. DNA的胶回收  35-36      2.7. 质粒的酶切鉴定  36-37      2.8. 质粒测序及结果比对分析  37    3. 实验结果与分析  37-38      3.1. 靶向猪Myostatin基因的shRNA设计  37-38      3.2. shRNA表达载体的酶切鉴定  38    4. 讨论  38-40  第四章 shRNA沉默猪Myostatin基因的研究  40-48    1. 材料与仪器  40-41      1.1. 主要实验材料与试剂  40      1.2. 主要实验仪器  40-41    2. 实验方法  41-45      2.1. 原代猪胎儿成纤维细胞的分离与培养  41      2.2. 细胞复苏、传代与冻存  41-42      2.3. Myostatin表达载体pXF2F-MSTN的构建  42      2.4. 细胞转染  42-43      2.5. 细胞总RNA提取与反转录  43-44      2.6. Realtime PCR检测瞬时转染shRNA表达载体后PEF细胞中有关基因的表达水平  44-45    3. 实验结果与分析  45-47      3.1. shRNA表达载体的功能验证和筛选  45-46      3.2. 监测shRNA介导的干扰素反应(IFN activation)  46-47    4. 讨论  47-48  第五章 表达shRNA的慢病毒载体构建及功能验证  48-56    1. 材料与仪器  48-49      1.1. 主要实验材料与试剂  48      1.2. 主要实验仪器  48-49    2. 实验方法  49-52      2.1. 表达shRNA的慢病毒载体构建  49-50      2.2. 重组慢病毒载体的酶切鉴定  50      2.3. 测序验证及结果分析  50      2.4. 慢病毒生产与浓缩  50-51      2.5. 慢病毒转导猪胎儿成纤维细胞  51      2.6. Realtime PCR检测慢病毒载体转导后猪胎儿成纤维细胞中有关基因的表达变化  51-52      2.7. 数据处理  52    3. 实验结果  52-54      3.1. 慢病毒的shRNA表达质粒的构建结果  52      3.2. 慢病毒表达质粒的酶切鉴定结果  52-53      3.3. 慢病毒载体介导的RNAi的沉默效果  53-54    4. 讨论  54-56  第六章 shRNA慢病毒载体长期、稳定地抑制PEF中Myostatin表达的研究  56-60    1. 材料与仪器  56      1.1. 主要实验材料与试剂  56      1.2. 主要实验仪器  56    2. 实验方法  56-57      2.1. 慢病毒转导猪胎儿成纤维细胞及Blasticidin筛选稳定细胞系  56-57      2.2. Realtime PCR检测慢病毒载体转导后猪胎儿成纤维细胞中有关基因的表达变化  57      2.3. 数据处理  57    3. 实验结果  57-58      3.1. 细胞筛选结果  57-58      3.2. 稳定细胞系中的RNAi效果研究  58    4. 讨论  58-60全文结论  60-62附录一  62-64附录二  64-66参考文献  66-76致谢  76

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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