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HCV 5\'UTR启动子活性研究

作　者: 陈娟
导　师: 黄爱龙
学　校: 重庆医科大学
专　业: 内科学
关键词: HCV 5’UTR 启动子 5 UTR 结构域启动子活性细胞系
分类号: R373.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

丙型肝炎病毒是黄病毒家族成员,其基因组为长约9.6kb的线状单股正链RNA,包括一个大的读码框架和两端的非翻译区(untranslating region,UTR),即5’UTR-C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-3’UTR。近十多年众多研究者对HCV进行了多方面的研究,由于缺乏稳定可靠的HCV全基因组复制的细胞模型及动物模型,因此对HCV的具体的复制及翻译机制目前仍知之甚少。HCV 5’UTR在HCV不同基因型相对保守和稳定,这种序列保守的特点可能在病毒复制和翻译的起始及调控上有重要作用。为研究HCV 5’UTR在HCV病毒复制过程中的具体作用,本实验通过构建HCV 5’-UTR cDNA正反向序列驱动的虫荧光素酶基因表达质粒和绿色荧光蛋白基因表达的质粒,发现HCV 5’UTR cDNA具有启动子活性,这种启动子活性在多种细胞系中均存在;通过构建系列缺失突变体,发现结构域Ⅲ是HCV 5’UTR cDNA具备启动子活性的核心结构。HCV 5’UTR cDNA启动子活性的发现,为全面认识HCV 5’UTR在HCV复制过程中发挥的功能提供了一条新的思路。目的:研究HCV 5’UTR cDNA序列在真核细胞中的启动子活性,全面认识HCV 5’UTR的功能,为研究HCV复制机制提供一条新的思路。方法:构建HCV基因组5’-UTR cDNA正反向序列驱动的虫荧光素酶基因表达质粒(pGL3-5’UTR/ pGL3-a-5’UTR)和5’UTR DNA序列驱动绿色荧光蛋白基因表达的质粒( pEGFP-5’UTR/ pEGFP-a-5’UTR),分别转染HepG2细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统,检测荧光素酶的表达情况,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因的表达水平,与相应对照作比较,证实HCV基因组5’-UTR cDNA序列的启动子活性。结果: pGL3-5’UTR有明显的虫荧光素酶表达,但比pGL3-Control表达水平低(FL/RL分别为2.87±1.13,16.78±4.12),而pGL3-a-5’UTR和pGL3-Enhancer(无启动子)无明显虫荧光素酶活性表达(FL/RL分别为0.68±0.19,0.40±0.15);逆转录聚合酶链反应与之相符,pGL3-5’UTR检测到虫荧光素酶基因mRNA,而pGL3-a-5’UTR未检测到。pEGFP-5’UTR观察到较强绿色荧光,pEGFP-a-5’UTR无荧光表达。结论:HCV基因组5’UTR cDNA序列具有明显的启动子活性,能启动下游基因的表达,而反义序列则没有;可能提示HCV 5’UTR有启动子功能。目的:寻找在HCV 5’UTR的二级结构中,与HCV 5’UTR cDNA启动子活性相关的结构域。方法:在pGL3-5’UTR质粒基础上,分别构建5’UTR不同结构域的DNA序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒pGL3-5’UTR1, pGL3-5’UTR2, pGL3-5’UTR3, pGL3-5’UTR4。将上述质粒分别转染HepG2细胞,pGL3-Control及pGL3-Enhancer为对照,用双荧光素酶报告基因检测系统,检测上述质粒荧光素酶的表达情况。结果:当四个结构域都具备时,荧光素酶相对活性为5.94±0.69,为SV40启动子的18.80%;失去结构域I以后,荧光素酶相对活性为9.45±2.03;失去结构域I和II以后,荧光素酶相对活性为2.64±0.79;失去结构域III和IV以后,荧光素酶相对活性为0.32±0.06;失去结构域IV以后,荧光素酶相对活性为2.72±0.90,逆转录聚合酶链反应结果与之相符。结论:结构域III是HCV5’UTR DNA序列具备启动子活性的核心结构,结构域I对其5’UTR DNA序列的启动子活性具有抑制效应,而结构域II和IV可增强5’UTR DNA序列的启动子活性。目的:研究当HCV 5’UTR作为启动子时,多种组织来源的细胞中,是否存在其发挥功能的辅助因子,并初步探讨其组织特异性。方法:将含HCV 5’UTR全序列cDNA的质粒pGL3-5’UTR转染人胎肝细胞L02、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞HeLa和人胚肾细胞HEK293,检测报告基因的表达差异。结果:在四种不同组织来源的细胞中,报告基因虫荧光素酶均能够得到不同程度的表达。表达强度由高到低依次是:L02>HepG2>HEK293>HeLa。与每种细胞中SV40启动子活性比较,其表达强度在上述细胞中分别为SV40启动子的23.42%、20.59%、11.00%、和9.09%。结论:多种组织或器官都可为HCV5’UTR发挥启动子功能提供辅助因子,但在肝源性细胞中,虫荧光素酶的表达相对较高,尤其是在正常的肝源性细胞中,这与临床上HCV主要引起肝细胞病变相一致。

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符号说明  6-8
中文摘要  8-12
英文摘要  12-16
论文正文：HCV UTR 的学位论文">5’UTR 启动子活性研究  16-54
  前言  16-18
  第一部分 HCV 5’UTR cDNA 启动子活性研究  18-37
    前言  18
    1 材料和方法  18-29
    2 结果  29-33
    3 讨论  33-35
    参考文献  35-37
  第二部分 HCV 5’UTR 启动子活性的结构定位  37-48
    前言  37-38
    1 材料和方法  38-41
    2 结果  41-45
    3 讨论  45-47
    参考文献  47-48
  第三部分 HCV 5’-UTR cDNA 在不同细胞系中的启动子活性比较..  48-54
    前言  48
    1 材料和方法  48-49
    2 结果  49-51
    3 讨论  51-52
    参考文献  52-54
全文总结  54-55
文献综述  55-63
致谢  63-64
硕士期间撰写和发表论文情况  64

HCV 5\'UTR启动子活性研究

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