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镉胁迫诱导拟南芥MLH1基因启动子甲基化变化的分子诊断

作 者: 单存海
导 师: 钟鸣;刘宛
学 校: 沈阳农业大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词:  错配修复基因 生物标记物 启动子 甲基化
分类号: X173
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


土壤重金属污染是当今污染面积最广、危害最大的环境问题之一,已成为影响我国可持续农业发展和生态环境质量的重要因素,倍受关注。然而单纯依靠化学方法进行土壤污染诊断,不能完全表征土壤的整体质量特征,需要生态毒理诊断方法做补充,因此生物标记物技术成为污染早期诊断的研究热点之一。本文采用重亚硫酸盐测序和结合重亚硫酸盐限制性分析技术,研究了(Cd)胁迫对拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)幼苗错配修复基因MutL-homologue 1 (MLH1)启动子甲基化的影响,并结合幼苗形态、生理指标和MLH1启动子碱基突变状况,筛选Cd胁迫敏感的生物标记物。主要结果如下:1.不同浓度(0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1) Cd胁迫处理3 d后,拟南芥幼苗生长均受到了不同程度的影响,其中幼苗叶片数、地上部鲜重对Cd毒性的响应相对迟钝,而幼苗初生根生长则受到了明显的抑制,可见重金属Cd优先作用于植物的根系,初生根生长对Cd毒性的响应较为敏感;2.不同浓度(0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1) Cd胁迫处理3 d后,拟南芥幼苗地上部可溶性蛋白质和叶绿素含量也受到了不同程度的影响。随着Cd浓度的增加,可溶性蛋白质含量较对照显著降低(P<0.05),叶绿素含量变化不明显,可见幼苗地上部可溶性蛋白质含量对Cd胁迫的敏感性高于叶绿素含量对Cd胁迫的敏感性;3.不同浓度(0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1) Cd胁迫处理3 d后,拟南芥幼苗错配修复基因MLH1启动子区域的碱基发生了一定程度的变化,但突变的比率很小,说明它们对低剂量的Cd胁迫不敏感;4.不同浓度(0、0.125、0.25、1.0、3.0 mg·L-1) Cd胁迫处理3 d后,拟南芥幼苗错配修复基因MLH1启动子甲基化水平随Cd浓度的增加较对照明显上升,说明它们对低剂量的Cd胁迫较为敏感;5.幼苗地上部可溶性蛋白质含量与错配修复基因MLH1启动子甲基化水平变化对Cd污染胁迫有较高的敏感性,并且二者与低剂量的Cd浓度之间存在显著的剂量-效应关系,说明它们可作为指示土壤Cd污染对植物遗传毒性效应潜在的、有用的生物标记物。尽管植物MLH1启动子区域DNA甲基化在一定程度上对土壤重金属污染胁迫表现为敏感响应的特点,但其在生态毒理诊断中的应用还需要今后进一步的研究予以证明。

全文目录


摘要  12-13英文摘要  13-15第一章 文献综述  15-27  1.1 土壤重金属污染  15-19    1.1.1 土壤重金属污染现状  15-16    1.1.2 土壤重金属来源分布与污染特点  16-17    1.1.3 土壤Cd污染及危害  17-19  1.2 污染土壤生态毒理学诊断  19-21    1.2.1 污染土壤生态毒理学诊断的概念  19    1.2.2 污染土壤生态毒理学诊断的意义  19-20    1.2.3 污染土壤生态毒理学诊断的基本准则  20    1.2.4 污染土壤生态毒理学诊断的常规试验方法  20-21  1.3 生物标记物在土壤诊断中的应用  21  1.4 DNA错配修复相关基因被用作生物标记物的研究概况  21-25    1.4.1 原核生物DNA错配修复系统  22-23    1.4.2 真核生物DNA错配修复系统  23    1.4.3 拟南芥DNA错配修复系统  23-24    1.4.4 DNA错配修复相关基因被用作生物标记物的研究进展  24-25  1.5 植物DNA甲基化的生物标记功能  25-26  1.6 本研究的目的与意义  26  1.7 本研究的内容与技术路线  26-27第二章 胁迫对拟南芥幼苗形态和生理指标影响的研究  27-36  2.1 材料、试剂与仪器  27-29    2.1.1 供试材料  27    2.1.2 主要试剂  27-28    2.1.3 主要仪器  28-29  2.2 方法  29-31    2.2.1 拟南芥幼苗的培养和胁迫处理  29    2.2.2 拟南芥幼苗形态指标的测定  29-30    2.2.3 拟南芥幼苗地上部生理指标的测定  30-31    2.2.4 数据分析  31  2.3 结果与分析  31-33    2.3.1 Cd胁迫对拟南芥幼苗叶片数、地上部鲜重、根长的影响  31-32    2.3.2 Cd胁迫对拟南芥幼苗地上部可溶性蛋白质和叶绿素含量的影响  32-33  2.4 结论与讨论  33-35    2.4.1 Cd胁迫对拟南芥幼苗生长、外部形态的影响  33-34    2.4.2 Cd胁迫对拟南芥幼苗地上部叶绿素含量的影响  34    2.4.3 Cd胁迫对拟南芥幼苗地上部可溶性蛋白质含量的影响  34-35  2.5 小结  35-36第三章 镉胁迫对拟南芥幼苗MLH1基因启动子突变的影响研究  36-53  3.1 材料、试剂与仪器  36-39    3.1.1 供试材料  36    3.1.2 主要试剂  36-38      3.1.2.1 主要药品  36-37      3.1.2.2 主要试剂的配制  37-38    3.1.3 仪器设备  38-39  3.2 方法  39-46    3.2.1 幼苗基因组DNA提取  39-41      3.2.1.1 基因组DNA提取步骤  39-40      3.2.1.2 DNA完整性检测  40-41      3.2.1.3 DNA纯度和浓度检测  41    3.2.2 MLH1基因启动子PCR扩增  41-43    3.2.3 MLH1基因启动子体外重组与转化  43-45    3.2.4 MLH1基因启动子测序与突变分析  45-46  3.3 结果与分析  46-49    3.3.1 幼苗基因组DNA提取纯度、浓度、完整性检测  46-47    3.3.2 MLH1基因启动子PCR扩增结果检测  47-48    3.3.3 Cd胁迫对拟南芥幼苗MLH1基因启动子突变的影响  48-49  3.4 结论与讨论  49-52    3.4.1 植物基因组DNA的提取  49-50    3.4.2 PCR体系的构建和优化  50-51    3.4.3 目的片段的体外重组与转化  51    3.4.4 Cd对拟南芥幼苗MLH1基因启动子的诱变作用  51-52  3.5 小结  52-53第四章 镉胁迫对拟南芥幼苗MLH1基因启动子甲基化的影响研究  53-68  4.1 材料、试剂与仪器  54-55    4.1.1 供试材料  54    4.1.2 主要试剂  54-55    4.1.3 仪器设备  55  4.2 方法  55-60    4.2.1 幼苗基因组DNA的提取  55    4.2.2 基因组DNA亚硫酸氢盐修饰  55    4.2.3 修饰后DNA纯化回收  55-57    4.2.4 修饰后DNA用于MLH1基因启动子甲基化特异性扩增  57-58    4.2.5 MLH1基因启动子甲基化水平分析  58-60  4.3 结果与分析  60-64    4.3.1 拟南芥幼苗MLH1基因启动子甲基化特异性扩增结果检测  60-61    4.3.2 Cd胁迫对拟南芥幼苗MLH1基因启动子甲基化的影响  61-64  4.4 结论与讨论  64-67    4.4.1 重盐修饰在甲基化检测方法中的重要性  64-65    4.4.2 错配修复基因MLH1启动子甲基化检测区域的选取  65-67    4.4.3 Cd胁迫对拟南芥幼苗MLH1基因启动子甲基化的影响  67  4.5 小结  67-68第五章 结论与展望  68-70  5.1 研究结论  68-69  5.2 前景展望  69-70参考文献  70-81致谢  81-82攻读学位期间发表学术论文  82

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境植物学
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