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藤稔葡萄花发育相关基因的克隆及表达分析

作　者: 张睿
导　师: 章镇
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄 启动子 FLOWERING LOCUS T FLOWERING LOCUS C APETALA3 AGAMOUS 克隆 表达
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


为解释植物开花这一复杂生命现象,近百年来科研工作者对成花机理进行了大量积极的探索。花发育的研究从生理生化层次逐步深入到分子水平。植物成花分子机理已在拟南芥、金鱼草等模式植物上取得了重要进展,大量功能基因得到分离鉴定,形成了复杂而精确的遗传调控网络,其中FLOWERING LOCUST、FLOWERING LOCUS C、APETALA3、AGAMOUS是调控成花时间及植物花器官原基分化与发育的四个关键基因。不同种类植物中这四个基因的同源基因在序列特征、表达模式和功能上具有相对保守性和不同程度的差异性。果树成花分子机理的研究起步较晚,相对落后。本实验以藤稔葡萄(Vitis vinifera×Vitis labrusca’Fujiminori’)为实验材料,克隆得到葡萄FLOWERING LOCUST、FLOWERING LOCUS C, APETALA3. AGAMOUS四个同源基因的cDNA序列及这四个基因上游的启动子序列,并通过相关软件,对它们的结构和功能进行了分析。同时对这四个基因在葡萄花期不同阶段的表达特性进行了初步研究。以期为深入了解葡萄花形态建成过程,调控葡萄的开花结实提供分子生物学基础。主要研究结果如下：1.采用克隆红富士葡萄FLOWERING LOCUST、FLOWERING LOCUS C、APETALA3和AGAMOUS全长编码区相同的引物,以藤稔葡萄花序的总RNA为模板,通过RT-PCR和3’RACE扩增得到这四个基因的cDNA序列。经过拼接得到藤稔葡萄FT基因cDNA序列长度为757 bp (GenBank登录号HM192810),包含一个完整的525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸残基。藤稔葡萄FLC基因cDNA序列长度为1038 bp (GenBank登录号HM192809),包含一个完整的632 bp的开放阅读框,编码210个氨基酸残基。藤稔葡萄AP3基因cDNA序列长度为1049 bp (GenBank登录号HM192808),包含一个完整的681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸残基。藤稔葡萄AG基因cDNA序列长度为1123 bp(GenBank登录号HM192807),包含一个完整的681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸残基。同时对这四个基因的生物信息学特性进行了初步分析。2.通过基于热不对称交错PCR的基因组步移法从藤稔葡萄中获得FLOWERING LOCUS T同源基因上游核酸片段长度为1605 bp,包含有基因区域135bp,实际的启动子区域长1470 bp (GenBank登录号HM192806)。获得的FLOWERING LOCUS C同源基因上游核酸片段长度为1788 bp,包含有基因区域90bp,实际的启动子区域长1698 bp(GenBank登录号HM192805)。获得的APETALA3同源基因上游核酸片段长度为1143 bp,包含有基因区域82 bp,实际的启动子区域长1061 bp (GenBank登录号HM192804)。获得的AGAMOUS同源基因上游核酸片段长度为1254 bp,包含有基因区域122 bp,实际的启动子区域长1132 bp(GenBank登录号HM192803)。经Plantcare在线预测表明这4个片段均含有启动子的特定结构及多个转录因子结合位点。3.以藤稔葡萄为材料,研究了FLOWERING LOCUS T、FLOWERING LOCUS C, APETALA3和AGAMOUS基因在葡萄花期的表达规律,结果表明,FT基因的表达量在藤稔葡萄整个花期稳步下降,但花前急剧上升,尤其是开花当天表达量达到最高值。FLC的表达量与FT相反,呈现较明显的先升后降的趋势。AP3在花期各阶段的表达量整体水平均不高,并呈缓慢下降的趋势。AG也呈现较明显的先升后降的趋势,在花前几天持续高表达。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-12缩略词  12-13引言  13-15第一章 文献综述  15-29  1 葡萄成花相关基因研究进展  15-23    1.1 高等植物花发育的过程  15    1.2 编码花发育程序的基因  15-18      1.2.1 成花计时基因  15-17      1.2.2 花分生组织基因  17      1.2.3 花器官特征基因  17-18    1.3 葡萄成花过程  18-21      1.3.1 葡萄的成花习性  18-19      1.3.2 影响葡萄成花的各种因子  19-21    1.4 葡萄花发育相关同源基因研究动态  21-23      1.4.1 FT研究进展  22      1.4.2 FLC研究进展  22      1.4.3 AG研究进展  22-23      1.4.4 AP3研究进展  23    1.5 小结  23  2 植物启动子研究进展  23-29    2.1 植物启动子结构与特征  23-25      2.1.1 植物启动子保守元件  24-25      2.1.2 植物启动子特异元件  25    2.2 植物启动子分类  25-27      2.2.1 组成型启动子  25-26      2.2.2 组织特异型启动子  26      2.2.3 诱导型启动子  26-27    2.3 启动子克隆方法  27-29      2.3.1 PCR方法  27-28      2.3.2 启动子探针  28-29第二章 藤稔葡萄花发育相关基因的克隆与生物信息学分析  29-53  1 材料与方法  30-34    1.1 材料  30      1.1.1 植物材料  30      1.1.2 主要试剂  30    1.2 方法  30-34      1.2.1 总RNA的提取与检测  30-31      1.2.2 总RNA中DNA的消化  31      1.2.3 cDNA第一链的合成  31      1.2.4 3'RACE引物设计  31-32      1.2.5 3‘RACE及编码区全长cDNA的扩增  32-33      1.2.6 葡萄成花相关基因序列生物信息学分析  33-34  2 结果与分析  34-51    2.1 总RNA提取  34    2.2 葡萄花发育相关基因克隆  34-36      2.2.1 FT基因  34      2.2.2 FLC基因  34-35      2.2.3 AP3基因  35-36      2.2.4 AG基因  36    2.3 葡萄花发育相关基因生物信息学分析  36-51      2.3.1 FT基因  36-40      2.3.2 FLC基因  40-43      2.3.3 AP3基因  43-47      2.3.4 藤稔葡萄AG基因  47-51  3 讨论  51-53第三章 藤稔葡萄花发育相关基因启动子的克隆  53-73  1 材料与方法  54-59    1.1 材料  54      1.1.1 植物材料  54      1.1.2 主要试剂  54    1.2 方法  54-59      1.2.1 总DNA提取  54      1.2.2 引物设计  54-55      1.2.3 PCR反应  55-57      1.2.4 PCR产物的回收及测序  57-58      1.2.5 测序结果分析  58-59  2 结果与分析  59-70    2.1 启动子克隆  59-60    2.2 序列分析及顺式元件预测  60-70  3 讨论  70-73第四章 藤稔葡萄花发育相关基因花期表达分析  73-83  1 材料与方法  73-75    1.1 植物材料  73    1.2 主要试剂及仪器  73-74    1.3 实时荧光定量PCR体系的建立  74-75      1.3.1 总RNA的提取与检测  74      1.3.2 总RNA中DNA的消化  74      1.3.3 cDNA第一链的合成  74      1.3.4 引物设计  74-75      1.3.5 反应体系  75      1.3.6 反应条件  75    1.4 数据分析  75  2 结果与分析  75-82    2.1 目的基因与内参基因引物扩增特异性验证  75-78    2.2 熔解曲线分析  78-81    2.3 葡萄花发育相关基因在藤稔花期的表达分析  81-82  3 讨论  82-83全文结论  83-85创新点  85-87参考文献  87-95附录  95-97致谢  97

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 浆果类 > 葡萄
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