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曲古抑菌素A（TSA）在IFN-γ调控TRIM22表达中的作用及其机制研究

作　者: 王雅新
导　师: 熊思东
学　校: 复旦大学
专　业: 免疫学
关键词: TSA TRIM22 IFN 诱导表达 组蛋白 干扰素刺激基因 泛素化 IRF 启动子活性 转录调控 荧光素酶 抑制剂 转录抑制 转录因子 质粒 Western 蛋白表达 调控表达 真核细胞 转染细胞
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


TRIM22 (Tripartite Motif 22)是TRIM蛋白家族成员之一。TRIM家族蛋白结构保守,与机体的多种生理功能有关,如细胞增殖、分化、发育和凋亡等。近年来研究发现多种TRIM家族蛋白在抗病毒固有免疫中发挥重要作用,其中研究最为深入的是TRIM5α。TRIM5a具有广泛的抗逆转录病毒作用,是恒河猴抵抗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的关键分子。值得关注的是,多种TRIM家族分子亦是干扰素(interferon,IFN)诱导基因,如TRIM5α、TRIM19、TRIM21、TRIM22、TRIM25和TRIM34等,它们在IFN介导的抗病毒固有免疫中起到重要作用,提示TRIM家族蛋白是一类新型抗病毒固有免疫分子。在正常生理条件下,TRIM22主要表达在外周血单个核细胞和淋巴组织,如胸腺和脾脏中,可能与造血细胞的分化有关。在受到IFN、脂多糖(LPS)及p53等因素刺激下,TRIM22可在多种组织细胞中显著上调表达。本课题组的前期工作发现TRIM22,而非TRIM5a,是肝细胞中被干扰素诱导表达最强的TRIM分子之一,并能有效抑制乙型肝炎病毒(HBV)的复制。急性HBV感染猩猩的肝基因组学研究亦发现,TRIM22与IFN以非细胞裂解方式清除HBV的过程相关。另有研究表明TRIM22,而非TRIM5a,参与干扰素的抗HIV作用,将TRIM22基因knockdown后,干扰素将不能有效抑制HIV的复制。这些研究结果均提示TRIM22是干扰素抗病毒过程中的关键效应分子。基于此,本课题组的前期工作对IFN-γ转录调控TRIM22的分子机制进行了研究。我们鉴定出一个在干扰素对TRIM22转录调控中起到关键作用的顺式作用元件——5’延伸的干扰素刺激反应元件(5’extended IFN-stimulating response element,5’elSRE),并发现干扰素调节因子(IFN regulatory factor, IRF)-1能与该反应元件结合,从而在IFN-y诱导TRIM22表达的过程中起到重要作用。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases. HDACs)在真核细胞基因的表观转录调控中起重要作用,HDACs通常被认为与真核细胞基因转录抑制相关。但新近研究发现HDACs对基因的转录调控比预想的要复杂得多：(1)HDACs亦可作为转录活化子来发挥功能；(2)除组蛋白外,HDACs亦可调控非组蛋白(如转录因子)的乙酰化水平；(3)HDACs亦在蛋白的泛素化修饰中起重要作用。尤为有趣的是,有研究发现HDACs抑制剂(如TSA)在IFN对某些基因的转录调控中发挥关键性的作用,但其机制仍不明确。大量研究表明,组蛋白乙酰化程度的降低与肿瘤的发生、发展密切相关。HDACs抑制剂(如TSA、NaB和VPA等)因可上调肿瘤细胞中组蛋白乙酰化水平、恢复正常的基因表达谱,从而在抗肿瘤治疗中备受关注。但人们在应用HDACs抑制剂治疗肿瘤的过程中发现,HDACs抑制剂处理可促进肝细胞中HCV和HBV的复制,这提示HDACs抑制剂可能影响某些具有重要抗病毒功能的干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)的表达。因本课题组的前期研究表明TRIM22在抗HBV固有免疫应答中起重要作用,且是干扰素抗病毒的关键效应分子,我们设想HDACs抑制剂对病毒复制的促进作用可能由于其阻断了IFN-γ对TRIM22的诱导表达所导致。为此,本课题将研究HDACs抑制剂对IFN-γ诱导TRIM22表达的影响,并在此基础上进一步探讨其作用机制,以期为基于TRIM22的抗病毒策略提供新的理论依据。第一部分TSA抑制IFN-γ对TRIM22的诱导表达前期的研究结果表明,TRIM22在肝细胞中的基础表达值低,但可被IFN-γ有效诱导表达。为研究HDACs抑制剂在IFN-γ诱导TR1M22表达中的作用,我们首先检测了一种常用的HDACs抑制剂——曲古抑菌素A (Trichostain A, TSA)对TRIM22诱导表达的影响。在TSA存在或不存在的情况下,利用IFN-γ刺激HepG2细胞,再通过实时定量PCR (qPCR)和Western blot技术分别检测TRIM22 mRNA和蛋白水平的表达。结果发现,TSA可在mRNA和蛋白水平上有效抑制IFN-γ对TRIM22的上调表达,并且这种抑制作用呈剂量和时效依赖性。为阐明TSA是在哪一层面影响了IFN-γ对TRIM22基因的诱导表达,我们在IFN-γ处理的HepG2细胞中加入转录抑制剂放线菌素D (AtcD)后,再行检测TSA对TRIM22 mRNA的影响。结果发现TSA并不影响IFN-γ诱导的TRIM22 mRNA的稳定性,提示TSA在IFN-γ诱导TRIM22表达中的作用可能发生在转录水平。为此,我们将TRIM22启动子依赖的荧光素酶报告质粒(pLuc-160)转入HepG2细胞中,转染24小时后,在TSA存在或不存在的情况下,用IFN-γ刺激HepG2细胞,随后检测转染细胞裂解液中的荧光素酶活性。结果发现,TSA可有效抑制IFN-γ诱导的TRIM22启动子活性,并且这种抑制作用亦具有剂量和时效依赖性,表明TSA是在转录水平上抑制IFN-γ对TRIM22的诱导表达。为检测TSA的抑制效应是否是通过特异性抑制HDACs的活性,我们进一步检测了另一种HDACs抑制剂——NaB对IFN-γ诱导的TRIM22转录活性的影响。结果发现,TSA和NaB均可在HepG2细胞中上调组蛋白H4的乙酰化水平,表明这两种抑制剂均可有效抑制HDACs的活性；重要的是,与TSA相类似,NaB亦可以剂量依赖的方式有效抑制IFN-γ诱导的TRIM22启动子活性,表明是HDACs活性的抑制导致IFN-γ不能有效诱导TRIM22的转录。第二部分TSA抑制IFN-γ对TRIM22诱导表达的分子机制本课题组的前期工作发现IRF-1通过与5’eISRE结合在IFN-γ诱导TRIM22的过程中发挥关键作用。因上述研究结果表明TSA在转录水平上抑制了IFN-γ对TRIM22的诱导表达,我们探究TSA是否可影响在TRIM22表达调控中起关键作用的转录因子IRF-1。在TSA存在或不存在的情况下,利用IFN-γ处理HepG2细胞6小时后,抽提核蛋白,然后通过基于ELISA的转录因子分析技术检测细胞核提取物中的IRF-1蛋白与5’eISRE的结合。结果发现,TSA处理组IRF-1与5’eISRE结合作用被显著抑制。Western blot结果亦表明TSA处理可导致核内IRF-I蛋白表达量显著降低。而后我们检测TSA处理不同时间后(0.5、1、2、6、12、24小时)IFN-γ诱导的IRF-1蛋白的表达情况,结果显示TSA在各个时间点均可明显抑制IFN-γ对IRF-1蛋白的诱导表达。为研究TSA对IRF-1蛋白水平的影响是否是因为TSA影响了IRF-1的转录,我们通过qPCR检测了TSA对IRF-1 mRNA水平的影响。结果发现,TSA并不显著影响IFN-γ对IRF-1mRNA的诱导表达。已知STAT1在IFN-γ对IRF-1的转录调控中起关键作用,因而我们检测了TSA对STAT1磷酸化的影响,结果发现TSA处理组与未处理组在IFN-γ诱导STAT1磷酸化水平上无明显差别。这些结果表明TSA并不明显影响IRF-1的转录。随后,我们检测了TSA对IRF-1蛋白稳定性的影响,发现在TSA存在的情况下,IFN-γ诱导的IRF-1蛋白的稳定性下降,即TSA处理导致IRF-1蛋白降解加快。进一步研究发现TSA亦可导致外源性转入的IRF-1蛋白降解加快。有研究表明IRF-1蛋白半衰期短,主要通过泛素—蛋白酶体途径被降解,而亦有研究发现,HDACs抑制剂可诱导某些蛋白的泛素化。因此,我们推测TSA可能通过增强IRF-1蛋白的泛素化水平,从而导致IRF-1蛋白的降解。利用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,再检测TSA对IFN-γ诱导IRF-1蛋白的表达情况。结果显示,MG132可以抑制TSA对于1RF-1蛋白的降解。同时,我们亦检测了溶酶体抑制剂氯喹(Chloroguine)在TSA促进IRF-1蛋白降解中的作用,发现Chloroguine对这一过程并没有影响。这些结果表明,TSA可能通过泛素—蛋白酶体途径促进IRF-1蛋白的降解。为了进一步验证这一结论,我们将IRF-1过表达质粒pIRF-1-Myc与Ub-HA质粒共转染HepG2细胞,而后用偶联Myc抗体的protein A/G进行pull-down,随后再用HA抗体进行Western blot检测。结果发现,TSA可明显增强IRF-1蛋白的泛素化水平。在生理条件下,TSA的靶基因HDAC1在体内主要发挥组蛋白去乙酰化功能。但近年来研究发现,HDAC1亦可在某些蛋白的去泛素化过程中起到重要作用。通过亲和素凝胶沉淀分析发现HDAC1与IRF-1均可结合到TRIM22启动子区域的5’eISRE上,这为HDAC1发挥对IRF-1的去泛素化作用提供了空间基础。进一步的研究发现,过表达HDAC1可明显降低IRF-1蛋白的泛素化水平。综上所述,本研究证实组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可通过泛素—蛋白酶体途径降解IRF-1蛋白,从而在转录水平上抑制IFN-γ对TR1M22的诱导表达。这为阐明抗乙肝病毒固有免疫分子TRIM22的调控表达和作用机制提供了新的实验依据。

全文目录


中文摘要  5-9
英文摘要  9-14
前言  14-17
第一部分 TSA可抑制IFN-γ对TRIM22的诱导表达  17-30
  材料与方法  17-21
  结果  21-28
  讨论  28-30
第二部分 TSA抑制IFN-γ对TRIM22诱导表达的机制  30-45
  材料和方法  30-35
  结果  35-43
  讨论  43-45
小结  45-46
参考文献  46-51
附录  51-52
致谢  52-53
综述  53-66
  参考文献  60-66

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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