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Pib结构基因在不同启动子驱动下的稻瘟病抗性

作　者: 晋玉宽
导　师: 杨世湖
学　校: 南京农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 水稻转基因稻瘟病 Pib基因启动子 ORF
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea Barr [无性世代为Pyricularia grisea Saco.]所引起的真菌性水稻病害(Herbert,1971),与纹枯病、白叶枯病并称为水稻的三大主要病害；几乎在每个栽培水稻的国家和地区都有此病发生,只要条件适宜,就容易流行成灾,甚至颗粒无收。解决这一难题的办法是培育抗病品种,通过基因工程方法将抗病基因导入水稻感病品种,对水稻抗病育种有着十分重要的理论意义和应用价值。Pib基因是水稻中通过图位克隆方法得到第一个抗稻瘟病主效基因(Wang Z X etal,1999),属于NBS-LRR抗病基因家族。该基因全长10322bp,包含3个外显子4个内含子,其中前两个内含子位于翻译起始密码子ATG上游区域。整个基因编码一个由1251个氨基酸组成的多肽,在氨基端NBS区含有Kinase la,2a和3a基序的重复结构,在羧基端的17段LRRs中存在两段由8个簇状排列半胱氨酸残基组成的结构,这在其它R基因中并没有发现。Pib基因的克隆为在分子水平研究抗病基因结构和功能之间的关系提供了材料。根据Pib基因的结构特点,本研究利用CaMV35S+Pib双启动子、CaMV35S启动子以及Pib启动子来驱动Pib基因全长结构基因的表达,相应载体分别命名为pNAR701、pNAR704和pNAR705,探索不同启动子驱动Pib结构基因mRNA量的差异以及由此所造成的稻瘟病抗性,并探讨启动子与抗病基因功能之间的关系。同时,利用CaMV35S启动子分别驱动Pib基因的第1、第3外显子的正/反义片段,分别构建了pNAR707/ pNAR708和pNAR702/ pNAR703表达载体,用以探索Pib结构基因不同片段与稻瘟病抗性之间的关系。为更进一步阐明Pib基因的功能,本研究根据Pib基因保守区的特点设计引物,构建了CaMV35S启动子驱动的Pib基因保守区的干扰表达载体pNAR706,从反向遗传学的角度对Pib基因的功能进行研究。对上述获得的双元表达载体以农杆菌介导转化水稻品种日本晴,共获得186株转基因植株,其中pNAR701的转化植株61株,pNAR702的转化植株12株,pNAR703的转化植株45株,pNAR704转化植株43株,pNAR705的转化植株25株,没有获得转pNAR706、pNAR707和pNAR708的转基因植株。经PCR、Southern blot分析表明,Pib基因片段已经整合到日本晴的基因组中,且全部为单拷贝。T0代种子对潮霉素抗性发芽试验发现,大部分转基因植株表现出3：1的抗感分离,表明潮霉素基因在转基因后代中是能够稳定遗传的。Northern blot分析显示：不同启动子驱动下的Pib基因不同片段都能够在转基因后代中表达,但mRNA量存在差异。实时荧光定量分析显示：Pib基因在pNAR701、pNAR703、pNAR704、pNAR705的T1代转基因小苗中都有所表达,701-1单株中mRNA的量最高,705-2的mRNA量最低；并且Pib基因的mRNA量在同一转基因事件的不同转基因单株之间存在差异(如701-1,701-2,701-3)。T1和T2代转基因植株苗期抗稻瘟病鉴定发现,不同启动子驱动Pib基因全长结构基因的稻瘟病抗性水平之间没有明显差异,都对ZBl和ZG1小种表现出高抗,且较对照日本晴的抗性增强五个等级,并且不同转基因株系间的稻瘟病抗性水平没有显著差异,除了ZB1和ZG1小种对对照日本晴的致病能力存在差异外,对所有供试转基因株系的致病性没有明显差异。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-11缩略语 11-13第一章文献综述 13-35 第一节水稻稻瘟病基础研究 13-19 1.1 稻瘟病病原真菌的生物学特征 13-14 1.2 稻瘟病的发病条件及发生过程 14-15 1.3 稻瘟病的症状表现 15-17 1.3.1 苗瘟 16 1.3.2 叶瘟 16 1.3.3 节瘟 16-17 1.3.4 穗颈瘟 17 1.3.5 谷粒瘟 17 1.4 稻瘟病的危害 17-18 1.5 稻瘟病生理小种鉴定 18-19 第二节抗稻瘟病基因研究 19-30 2.1 稻瘟病抗性基因的分子定位 19-22 2.2 水稻抗瘟性遗传研究 22-23 2.3 稻瘟病抗性基因的克隆 23-29 2.3.1 Pib基因的克隆 24-25 2.3.2 Pi-ta基因的克隆 25-26 2.3.3 Pi-2、Piz-t和Pi-9基因的克隆 26-27 2.3.4 Pi-d2基因的克隆 27 2.3.5 Pi-36基因的克隆 27-28 2.3.6 Pi-37基因的克隆 28 2.3.7 Pi-k~m基因的克隆 28-29 2.3.8 Pi-5基因的克隆 29 2.4 稻瘟病抗性的鉴定技术 29-30 2.5 稻瘟病菌的基因组学研究 30 第三节水稻遗传转化研究进展 30-34 3.1 水稻转化受体系统 31-32 3.1.1 原生质体再生系统 31 3.1.2 愈伤组织再生系统 31 3.1.3 幼嫩子房转化系统 31-32 3.2 常用的基因转化方法 32-34 3.2.1 基因枪法 32 3.2.2 农杆菌介导法 32-33 3.2.3 花粉管通道法 33 3.2.4 PEG转化法 33 3.2.5 电激法 33-34 第四节本研究的目的和意义 34-35第二章植物表达载体的构建 35-45 摘要 35 1 材料和方法 35-38 1.1 实验材料 35-36 1.1.1 质粒与菌株 35 1.1.2 试剂 35 1.1.3 质粒抽提液 35-36 1.1.4 培养基 36 1.2 方法 36-38 1.2.1 CaCl_2法制备大肠肝菌感受态细胞的制备 36 1.2.2 质粒提取 36-37 1.2.3 酶切产物的回收(参见鼎国产品说明书) 37 1.2.4 连接反应与转化 37 1.2.5 根癌农杆菌EHA105感受态的制备和转化 37-38 2 结果与分析 38-45 2.1 Pib基因的外显子特点 38-39 2.2 Pib基因的酶切位点分析 39 2.3 Pib基因及双元载体pPZP2Ha3(+/-)/pCMBIA1302的鉴定 39 2.4 pNAR701/pNAR705的构建 39-40 2.5 pNAR702/pNAR703的构建 40-41 2.6 pNAR704的构建 41-42 2.7 pNAR706的构建 42-43 2.8 pNAR707/pNAR708的构建 43-44 2.9 双元载体转化农杆菌EHA105 44-45第三章农杆菌介导的转基因水稻植株获得 45-55 摘要 45 1 材料与方法 45-51 1.1 实验材料 45-46 1.1.1 转基因受体品种 45 1.1.2 质粒和菌株 45 1.1.3 试剂和试剂盒 45-46 1.2 方法 46-51 1.2.1 水稻愈伤组织的诱导、继代培养和农杆菌转化 46-47 1.2.2 转基因水稻离体叶片潮霉素抗性鉴定 47 1.2.3 水稻基因组DNA的提取 47-48 1.2.4 转基因植株的PCR检测 48 1.2.5 转基因水稻T_0代种子的潮霉素发芽鉴定 48 1.2.6 水稻叶片总DNA的提取 48-49 1.2.7 转基因水稻的Southern blot鉴定 49-51 2 结果与分析 51-55 2.1 转基因水稻植株的获得 51-52 2.2 转基因水稻叶片的离体抗潮霉素鉴定 52 2.3 转基因植株的PCR鉴定 52-53 2.4 转基因T_0代种子的潮霉素发芽鉴定 53-54 2.5 转基因植株的Southern blot 54-55第四章转基因植株分析及抗病性鉴定 55-65 摘要 55 1 材料与方法 55-59 1.1 实验材料 55-56 1.1.1 试剂和仪器 55 1.1.2 缓冲液与培养基 55-56 1.2 方法 56-59 1.2.1 水稻总RNA的提取 56 1.2.2 水稻的Northern blot鉴定 56-57 1.2.3 T_1代转基因植株的荧光定量分析 57-58 1.2.4 转基因植株离体叶片的接菌鉴定 58 1.2.5 T_1和T_2代转基因植株苗期的稻瘟病抗性鉴定 58-59 2 结果与分析 59-63 2.1 转基因植株的Northern blot分析 59 2.2 T_1转基因植株的实时荧光定量PCR分析 59-63 2.2.1 实时荧光定量PCR条件的优化选择 59-60 2.2.2 T_1代转基因植株的实时荧光定量分析 60-61 2.2.3 T_1转基因植株的分蘖期离体叶片抗瘟性鉴定 61-62 2.2.4 T_1和T_2代转基因植株苗期的抗瘟性鉴定 62-63 3. 讨论 63-65全文总结 65-66参考文献 66-72附录 72-75攻读硕士期间发表的论文 75-76致谢 76

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