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棉花和番茄P-ATPases基因的克隆及功能的初步分析

作 者: 陈菲
导 师: 刘蔼民
学 校: 南京农业大学
专 业: 作物遗传育种
关键词: P-type ATPases 克隆 农杆菌介导 启动子
分类号: S562
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


P-type ATPases是真核生物和很多原核生物中具有重要作用的酶,与植物生长发育以及植物逆境抗性等有密切关系。目前,还未见到关于研究棉花和番茄P-type ATPases的报道。本研究克隆了棉花和番茄的P-type ATPases基因,分析该基因在植物不同器官组织和多种逆境条件下的表达情况,并分别转化烟草或番茄,初步阐明其在植物生长发育和逆境抗性中的作用,为这两种作物的遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1.利用棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)的P-type ATPases蛋白序列,在GeneBank中搜索棉花EST序列,得到棉花两个同源的EST片段,结合RACE和Genome walking获得了这个基因的完整读码框序列,其开放阅读框长为3570bp,编码1190个氨基酸,与毛果杨、蓖麻的氨基酸同源相似性达90%左右,命名为Gbpatp。亚细胞定位结果显示Gbpatp编码的蛋白分布在细胞膜上。RT-PCR检测组织表达特异性分析表明,棉花P-type ATPases在茎和棉铃中的表达量较高,在种子中有低水平表达,而在叶子和花蕾中表达量极低,说明Gbpatp可能与棉花茎、棉铃和种子的生长发育密切相关。棉花幼苗在干旱处理后,Gbpatp的表达量大幅提高,并且随处理时间延长表达量逐渐增加;重金属Cu2+处理后Gbpatp的表达量升高,但48h比24h的表达量显著下降;低温处理24h Gbpatp的表达量略有升高。外源激素诱导后发现,Gbpatp对外源GA和ABA均有响应,随诱导时间延长Gbpatp在24h和48h的表达量维持在一定水平。据此推测Gbpatp基因与植物逆境抗性有密切关系。为研究棉花Gbpatp基因的功能,构建过量表达载体PCXSN-Gbpatp,转化烟草,获得12株转基因植株。2.在GeneBank中搜索到番茄的两个EST序列与黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)的P-type ATPases蛋白序列同源,分别为TC192175和BP896315。将检索到的EST序列对照BAC文库进行比对和拼接,根据生物学软件预测开放阅读框,并设计引物扩增番茄cDNA序列,得到一完整序列,命名为Lepatp。根据Lepatp基因序列构建RNA干扰载体2301-P1-P2,农杆菌介导法转化番茄,再生植株经PCR检测,获得11株转基因植株。转基因植株RT-PCR分析发现5株植株没有检测到Lepatp基因,说明Lepatp基因的表达已成功被抑制。与非转基因对照相比,Lepatp基因的表达沉默抑制了根系的发育,说明Lepatp基因与植物根系的生长发育相关,可能影响植物的营养吸收、生长和抗逆性等。3.根据已克隆的番茄Lepatp基因序列,电子克隆该基因的启动子序列,并构建植物表达载体转化拟南芥。PCR检测获得4株转基因植株。为了观察番茄P-type ATPases基因启动子在拟南芥中的表达特征,取转基因拟南芥的各个器官进行GUS组织的化学染色。结果表明,不同组织中GUS的表达量存在差异。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10英文缩略词表  10-11第一部分 文献综述  11-19  1. P-type ATPases概述  11-15    1.1 P-type ATPases的研究进展  11    1.2 P-type ATPases的基因组学  11-13    1.3 P-type ATPasess的结构  13    1.4 P-type ATPasess的作用机理  13-14    1.5 P-type ATPasess的功能  14-15  2 植物中RNA干扰(RNAi)技术研究进展  15-19    2.1 RNA干扰(RNAi)的发现  15    2.2 RNA干扰(RNAi)的作用机制  15-16    2.3 RNAi在植物中的应用  16-19第二部分 研究目的与意义  19-21第三部分 研究报告  21-51  1. 材料与方法  21-34    1.1 试验材料  21    1.2 棉花和番茄总RNA的提取和cDNA的合成  21-22    1.3 基因克隆  22-25    1.4 棉花幼苗的激素和胁迫处理  25-26    1.5 棉花Gbpatp基因表达产物的亚细胞定位  26-28    1.6 载体的构建  28-31    1.7 转基因烟草的遗传转化及分子鉴定  31-32    1.8 转基因番茄的遗传转化及分子检测  32-34    1.9 转基因拟南芥的遗传转化及分子检测  34    1.10 番茄Lepatp启动子的组织特异性鉴定  34  2 结果与分析  34-49    2.1 棉花Gbpatp全长基因的分离  34-37    2.2 棉花Gbpatp表达模式分析  37    2.3 棉花Gbpatp表达产物的亚细胞定位  37-38    2.4 棉花过量表达载体PCXSN-Gbpatp的鉴定  38-39    2.5 烟草的遗传转化和分子检测  39-40    2.6 番茄Lepatp全长基因的分离  40-42    2.7 番茄Lepatp RNAi载体的PCR检测和酶切验证  42-43    2.8 番茄遗传转化和分子检测  43-45    2.9 番茄Lepatp基因启动子的克隆及表达载体的PCR检测  45-47    2.10 拟南芥的遗传转化及分子检测  47-48    2.11 启动子的组织化学定位  48-49  3 讨论  49-51全文结论  51-53创新性  53-55参考文献  55-59附录  59-63攻读学位期间发表的学术论文  63-65致谢  65

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 >
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