学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
棉花和番茄P-ATPases基因的克隆及功能的初步分析
作 者: 陈菲
导 师: 刘蔼民
学 校: 南京农业大学
专 业: 作物遗传育种
关键词: P-type ATPases 克隆 农杆菌介导 启动子
分类号: S562
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 10次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
P-type ATPases是真核生物和很多原核生物中具有重要作用的酶,与植物生长发育以及植物逆境抗性等有密切关系。目前,还未见到关于研究棉花和番茄P-type ATPases的报道。本研究克隆了棉花和番茄的P-type ATPases基因,分析该基因在植物不同器官组织和多种逆境条件下的表达情况,并分别转化烟草或番茄,初步阐明其在植物生长发育和逆境抗性中的作用,为这两种作物的遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1.利用棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)的P-type ATPases蛋白序列,在GeneBank中搜索棉花EST序列,得到棉花两个同源的EST片段,结合RACE和Genome walking获得了这个基因的完整读码框序列,其开放阅读框长为3570bp,编码1190个氨基酸,与毛果杨、蓖麻的氨基酸同源相似性达90%左右,命名为Gbpatp。亚细胞定位结果显示Gbpatp编码的蛋白分布在细胞膜上。RT-PCR检测组织表达特异性分析表明,棉花P-type ATPases在茎和棉铃中的表达量较高,在种子中有低水平表达,而在叶子和花蕾中表达量极低,说明Gbpatp可能与棉花茎、棉铃和种子的生长发育密切相关。棉花幼苗在干旱处理后,Gbpatp的表达量大幅提高,并且随处理时间延长表达量逐渐增加;重金属Cu2+处理后Gbpatp的表达量升高,但48h比24h的表达量显著下降;低温处理24h Gbpatp的表达量略有升高。外源激素诱导后发现,Gbpatp对外源GA和ABA均有响应,随诱导时间延长Gbpatp在24h和48h的表达量维持在一定水平。据此推测Gbpatp基因与植物逆境抗性有密切关系。为研究棉花Gbpatp基因的功能,构建过量表达载体PCXSN-Gbpatp,转化烟草,获得12株转基因植株。2.在GeneBank中搜索到番茄的两个EST序列与黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)的P-type ATPases蛋白序列同源,分别为TC192175和BP896315。将检索到的EST序列对照BAC文库进行比对和拼接,根据生物学软件预测开放阅读框,并设计引物扩增番茄cDNA序列,得到一完整序列,命名为Lepatp。根据Lepatp基因序列构建RNA干扰载体2301-P1-P2,农杆菌介导法转化番茄,再生植株经PCR检测,获得11株转基因植株。转基因植株RT-PCR分析发现5株植株没有检测到Lepatp基因,说明Lepatp基因的表达已成功被抑制。与非转基因对照相比,Lepatp基因的表达沉默抑制了根系的发育,说明Lepatp基因与植物根系的生长发育相关,可能影响植物的营养吸收、生长和抗逆性等。3.根据已克隆的番茄Lepatp基因序列,电子克隆该基因的启动子序列,并构建植物表达载体转化拟南芥。PCR检测获得4株转基因植株。为了观察番茄P-type ATPases基因启动子在拟南芥中的表达特征,取转基因拟南芥的各个器官进行GUS组织的化学染色。结果表明,不同组织中GUS的表达量存在差异。
|
全文目录
摘要 6-8ABSTRACT 8-10英文缩略词表 10-11第一部分 文献综述 11-19 1. P-type ATPases概述 11-15 1.1 P-type ATPases的研究进展 11 1.2 P-type ATPases的基因组学 11-13 1.3 P-type ATPasess的结构 13 1.4 P-type ATPasess的作用机理 13-14 1.5 P-type ATPasess的功能 14-15 2 植物中RNA干扰(RNAi)技术研究进展 15-19 2.1 RNA干扰(RNAi)的发现 15 2.2 RNA干扰(RNAi)的作用机制 15-16 2.3 RNAi在植物中的应用 16-19第二部分 研究目的与意义 19-21第三部分 研究报告 21-51 1. 材料与方法 21-34 1.1 试验材料 21 1.2 棉花和番茄总RNA的提取和cDNA的合成 21-22 1.3 基因克隆 22-25 1.4 棉花幼苗的激素和胁迫处理 25-26 1.5 棉花Gbpatp基因表达产物的亚细胞定位 26-28 1.6 载体的构建 28-31 1.7 转基因烟草的遗传转化及分子鉴定 31-32 1.8 转基因番茄的遗传转化及分子检测 32-34 1.9 转基因拟南芥的遗传转化及分子检测 34 1.10 番茄Lepatp启动子的组织特异性鉴定 34 2 结果与分析 34-49 2.1 棉花Gbpatp全长基因的分离 34-37 2.2 棉花Gbpatp表达模式分析 37 2.3 棉花Gbpatp表达产物的亚细胞定位 37-38 2.4 棉花过量表达载体PCXSN-Gbpatp的鉴定 38-39 2.5 烟草的遗传转化和分子检测 39-40 2.6 番茄Lepatp全长基因的分离 40-42 2.7 番茄Lepatp RNAi载体的PCR检测和酶切验证 42-43 2.8 番茄遗传转化和分子检测 43-45 2.9 番茄Lepatp基因启动子的克隆及表达载体的PCR检测 45-47 2.10 拟南芥的遗传转化及分子检测 47-48 2.11 启动子的组织化学定位 48-49 3 讨论 49-51全文结论 51-53创新性 53-55参考文献 55-59附录 59-63攻读学位期间发表的学术论文 63-65致谢 65
|
相似论文
- 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
- 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
- 抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究,S482.2
- 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
- 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
- 水稻茎叶特异表达基因启动子的筛选及分析,S511
- 军曹鱼生长激素基因(GH)的克隆和表达,Q786
- 企鹅珍珠贝Cd-MT酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的初步研制,X835
- 甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究,R392
- 条纹斑竹鲨和鲫鱼BAFF基因的克隆和性质分析,S917.4
- Pseudomonas sp.RT-1低温脂肪酶发酵条件优化、纯化及基因的克隆表达,TQ925
- 棉铃虫和烟夜蛾生殖生物学特性比较研究,S433
- 猪BMP7基因启动子多态性及其与繁殖性状关联性分析,S828
- 红笛鲷清道夫受体B型Ⅰ类和抗冻蛋白Ⅱ型基因的克隆、表达与定量分析,S917.4
- STLV-1病毒间接ELISA方法建立及杂交瘤细胞株的筛选,R373
- Thermobifida Halotolerans YIM 90462~T木聚糖酶基因克隆表达以及酶学特性研究,Q78
- 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
- 害虫捕食性天敌拟环纹豹蛛烟碱型乙酰胆碱受体毒理学特性研究,S476.2
- 一个油菜菌核病抗病相关基因的功能初步分析,S435.654
- 硅、硫对水稻砷吸收、积累的影响机制研究,S511
- 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
© 2012 www.xueweilunwen.com
|