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Pib基因启动子3’端缺失体的暗诱导特性分析

作 者: 刘凯
导 师: 杨世湖
学 校: 南京农业大学
专 业: 遗传学
关键词: 水稻 Pib启动子 3’端缺失 暗诱导
分类号: S511
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


Pib基因属于NBS-LRR抗病基因家族,是从水稻中克隆出的第一个抗稻瘟病主效基因。前人研究发现,病原菌不是Pib基因表达的诱导因素,相反,黑暗处理、温度、茉莉酸、水杨酸等却能有效地诱导Pib基因的表达。李婵娟证实了Pib基因这一特殊表达方式是其启动子的属性;邵克强用不同长度Pib启动子的5’端缺失体转化水稻,研究了顺式作用元件YTCANTYY的拷贝数目与该启动子启动活性和暗诱导性的关系,结果表明YTCANTYY是赋予Pib启动子暗诱导性的功能性元件,而且其暗诱导活性可能是累加的。目前通常认为启动子3’端的-25序列TATA box和-75序列CAAT box是影响真核启动子启动功能的关键性顺式元件,决定着转录起始位点及其起始频率,是大多数真核基因正确表达所必需的。用PLACE数据库对Pib基因启动子序列进行扫描,发现Pib基因启动子中这两个基序都是多拷贝的,且Pib启动子携带的6个YTCANTYY暗诱导元件中只有2个位于-3 042至-3 389区段,也就是说其大部份拷贝也是位于ATG信号上游的3’端区段,与多数TATA box和CAAT box处于同一区域。鉴于3’端核心区段对基因转录表达的重要性,要了解Pib启动子3’末端TATA box和CAAT box的缺失对启动效率和诱导活性有无影响?暗诱导元件YTCANTYY在其3’端下游TATA box和CAAT box缺失情况下是否具有暗诱导活性,以及它们的数目与诱导性有无对应关系等问题,对研究Pib启动子的结构和功能非常重要。本文报道Pib3’端缺失启动子融合报告基因的构建方式,经转基因途径研究YTCANTYY顺式作用元件在此情况下与Pib启动子暗诱导活性之间的关系。1.采用PCR扩增法构建了载体pNAR1001 (含2个YTCANTYY元件,3个CAAT box,1个TATA box)、pNAR1002(含4个YTCANTYY元件,10个CAAT box,2个TATA box)和pNAR1003(含6个YTCANTYY元件,13个CAAT box,7个TATA box),重组质粒经酶切鉴定后用冻融法转化农杆菌菌株EHA105。2.采用农杆菌介导法,将构建的载体转化水稻品种R109成熟胚愈伤中,获得转基因植株pNAR100128株、pNAR100238株、pNAR100332株;用gus和hpt引物对转基因植株进行PCR检测,同时能扩增出441 bp和509 bp的特异性条带,阳性转基因植株Southern杂交均有杂交信号,对照植株无杂交信号,表明所转基因已整合入水稻基因组中。3.我们对不同长度启动子构建的转基因与对照植株的根、茎、叶组织进行了GUS活性荧光定量分析。黑暗处理前转基因植株各器官GUS活性都高于对照,且都是根部GUS活性大大高于茎、叶,具有器官特异性。对照植株在24 h黑暗处理后,无明显变化;不同构建pNAR1001、pNAR1002和pNAR1003的转基因植株在24 h暗诱导前后,GUS活性变化趋势相同,都是根中最高,茎次之、叶最低。24 h暗处理后转基因植株根部的GUS活性大幅增长,但茎和叶中GUS活性只有pNAR1003有成倍的增长。结果表明,Pib启动子的暗诱导启动活性主要由YTCANTYY暗诱导元件所决定,启动子下游的TATA Box、CAAT基序在Pib基因序列中并不是不可缺少的。也就是说,YTCANTYY不仅有暗诱导响应还能补偿TATA、CAAT所缺失的功能。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10第一章 文献综述  10-26  第一节 水稻稻瘟病的研究进展  10-15    1 稻瘟病病原物  10    2 稻瘟病的症状及发病规律  10-11    3 稻瘟病菌侵染与为害机理  11    4 稻瘟病抗病育种基础理论研究  11-12    5 抗稻瘟病基因研究进展  12-15  第二节 水稻遗传转化研究  15-21    1 水稻转化受体系统  15-16    2 水稻遗传转化方法  16-18    3 水稻转化中报告基因的选择  18-19    4 植物转基因存在的问题  19-21  第三节 植物启动子的研究  21-26    1 植物基因启动子结构及功能  21-22    2 植物启动子的类型以及应用  22-24    3 启动子的选择和改造  24-26第二章 Pib基因3’端缺失启动子驱动gus基因表达载体的构建  26-36  1 材料和方法  26-30    1.1 实验材料  26-27    1.2 实验方法  27-30  2 结果与分析  30-36    2.1 转基因载体构建示意图  30-32    2.2 转基因载体构建  32-34    2.3 重组双元载体转化农杆菌EHA 105  34-36第三章 农杆菌介导的转基因植株的获得  36-46  1 材料与方法  36-42    1.1 实验材料  36-38    1.2 实验方法  38-42  2 结果与分析  42-46    2.1 转基因水稻植株的获得  42-43    2.2 转基因水稻叶片抗潮霉素鉴定  43-44    2.3 转基因植株的PCR和Southern blot检测  44-46第四章 Pib基因启动子暗诱导元件的3’端缺失转基因分析  46-52  1 材料和方法  47-48    1.1 实验材料与试剂  47    1.2 实验方法  47-48  2 结果与分析  48-50    2.1 不同长度Pib启动子-gus构建转基因愈伤的GUS组织化学检测  48-49    2.2 不同长度Pib启动子-gus构建转基因植株的GUS活性定量分析  49    2.3 不同长度Pib启动子-gus构建转基因植株的暗诱导活性定量分析  49-50  3 分析与讨论  50-52第五章 全文结论  52-54参考文献  54-60攻读硕士期间发表的论文  60-62致谢  62

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