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靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF1和ORF7 shRNA重组慢病毒的构建与鉴定

作　者: 李治军
导　师: 姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PRRSV 慢病毒 RNAi 细胞系
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起,是目前造成世界范围内养猪业经济损失最为严重的传染病之一。RNAi技术最突出的优点是具有强大的抑制基因表达的效应和高度的序列特异性。慢病毒能够高效感染处于静止期和分裂期的细胞,这使得它成为实现长期基因表达的理想工具。本研究将慢病毒和RNAi技术相结合,从而为进一步抑制PRRSV感染提供新的思路。研究内容包括：1.在实验室先前工作的基础之上,将H1-shRNA表达框经PCR扩增后克隆至慢病毒载体质粒pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen,将鉴定正确的重组慢病毒载体质粒分别与包装质粒、包膜质粒共转染293FT细胞,生产出表达针对PRRSV S1株ORF1b、ORF7 shRNA的重组慢病毒,分别命名rLV-P3和rLV-N3,测定其病毒滴度都约为1.0×107efu/mL.2.以PRRSV SY0608株ORF1基因为siRNA靶基因,设计合成5对具有小发夹结构的两条寡核酸序列,经退火形成互补双链,再克隆至慢病毒载体质粒pLVX-shRNA,将鉴定正确的重组慢病毒载体质粒分别与Packaging Mixer共转染293FT细胞,生产出5种重组慢病毒,分别命名为rLV-NP1, rLV-NP2, rLV-NP7, rLV-NP9,rLV-NP11,测定其病毒滴度都达到5×105IFU/mL左右。3.将rLV-NP9以一定剂量感染Marc-145细胞,培养48h后经过流式细胞仪筛选,无菌分离出表达绿色荧光蛋白的细胞。将分离出的细胞扩大培养,细胞形态稳定,并且可以正常传代。提取细胞基因组进行PCR鉴定,建立了表达靶向PRRSV SY0608株ORF1 shRNA的Marc-145细胞系,将此细胞系命名为shRNAEGFP-Marc-145细胞。4.将PRRSV SY0608株以一定剂量接种shRNAEGFP-Marc-145细胞和正常Marc-145细胞,48h后首先观察细胞病变(CPE),同时测定细胞上清中的TCID50,并用荧光定量PCR法(Real-time PCR)测定病毒mRNA的含量。结果显示PRRSV SY0608株在这两种细胞系上形成的CPE没有明显差异,同时细胞上清中病毒的TCID50和mRNA含量也没有明显差异,说明shRNAEGFP-Marc-145细胞系不能够显著抑制PRRSVSY0608株的复制。

全文目录


摘要  7-8ABSTRACT  8-10第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展  10-30  1 PRRSV的生物学特性  10-11  2. PRRSV基因编码的蛋白  11-15    2.1 非结构蛋白  11-12    2.2 结构蛋白  12-15  3 PRRSV的免疫学特性  15-16    3.1 体液免疫  15    3.2 细胞免疫  15-16  4 疫苗研究  16-18    4.1 PRRSV新型佐剂疫苗  16-17    4.2 载体疫苗  17    4.3 DNA疫苗  17-18  参考文献  18-30第二章 慢病毒介导的RNA干扰研究进展  30-52  1 RNAI的分子机制  30-33    1.1 小干扰RNA  31-32    1.2 微小RNA  32-33  2 sIRNA靶序列的设计和制备  33-35    2.1 siRNA靶序列的设计  33    2.2 siRNA靶序列的制备  33-35  3 慢病毒载体  35-38    3.1 基于HIV-1的慢病毒载体  35    3.2 HIV-1的基本结构  35-36    3.3 基于HIV-1的慢病毒载体发展  36-38  4 慢病毒介导的RNAI在抗病毒方面的应用  38-43    4.1 艾滋病病毒  39-41    4.2 肝炎病毒  41    4.3 人乳头瘤病毒  41    4.4 柯萨奇病毒  41-42    4.5 乙型脑炎病毒  42    4.6 朊病毒  42-43  参考文献  43-52第三章 靶向PRRSV ORF1和ORF7shRNA重组慢病毒的构建及滴度测定  52-66  1 材料与方法  52-59    1.1 材料  52-53    1.2 方法  53-59  2 结果  59-62    2.1 慢病毒载体质粒pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen,包装质粒psPAX2,包膜质粒pMD2.G的酶切鉴定  59    2.2 PH1-shRNA表达框的扩增和重组慢病毒载体质粒的构建  59-61    2.3 慢病毒的包装  61    2.4 慢病毒滴度的测定  61-62    2.5 慢病毒感染Marc-145细胞  62  3 讨论  62-66第四章 靶向PRRSV ORF1 shRNA重组慢病毒的构建及滴度测定  66-76  1 材料与方法  66-70    1.1 材料  66-67    1.2 方法  67-70  2 结果  70-71    2.1 重组慢病毒载体质粒的鉴定  70-71    2.2 慢病毒的包装  71    2.3 慢病毒滴度测定  71  3 讨论  71-73  参考文献  73-76第五章 shRNA~(EGFP)-MARC-145细胞系的建立及其体外抑制PRRSV复制研究  76-88  1 材料与方法  76-80    1.1 材料  76-77    1.2 方法  77-80  2 结果  80-84    2.1 rLV-NP9感染Marc-145细胞  80-81    2.2 流式细胞仪筛选结果  81    2.3 筛选细胞的绿色荧光蛋白表达和细胞形态观察  81-82    2.4 PCR鉴定结果  82    2.5 质粒酶切鉴定并测序  82-83    2.6 细胞病变(CPE)与TCID_(50)测定结果  83-84    2.7 实时PCR结果  84  3 讨论  84-88全文总结  88-90致谢  90-92附录  92

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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