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水稻Pib启动子中乙烯和茉莉酸响应元件的转基因分析

作　者: 余丽
导　师: 杨世湖
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传学
关键词: 水稻 Pib基因启动子 gus 乙烯茉莉酸
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件,在转录水平上参与调控下游相应基因的表达,是转录调控的核心环节,也是研究基因的表达调控机理的重要内容。通过制备启动子的部分序列缺失并将得到的缺失片段与报告基因构建成融合基因,转化后比较转基因植株中报告基因表达状况来研究启动子中一些分子元件的功能,是启动子结构和功能研究的重要方法。Pib基因是利用图位克隆技术从水稻中克隆出的第一个抗稻瘟病主效基因,属于NBS-LRR抗病基因家族,前人研究Pib基因供体品种植株的抗稻瘟性表达受到乙烯、茉莉酸、水杨酸、氯化钠和黑暗等因素的诱导而不受病原菌接种的诱导。有关水杨酸、氯化钠和黑暗等诱导因素与Pib启动子中分子元件的关系已有了转基因分析的报道。乙烯和茉莉酸是植物防御反应的重要信号分子,在植物对生物性和非生物性因素的抗性以及植物生长和发育过程中的基因调控上发挥着重要的作用。然而,Pib基因的乙烯和茉莉酸诱导响应是否是启动子的响应,以及有关乙烯和茉莉酸诱导因素与启动区域内分子元件的关系还需要实验验证。为了分析Pib启动子中应答乙烯和茉莉酸的分子机制,确定乙烯和茉莉酸诱导的必需序列区域,本文采用了启动子缺失的方法构建了不同长度的5’端pib基因启动子驱动gus基因的双元载体,通过转基因技术平台和报告基因体系来研究该pib启动子中乙烯和茉莉酸诱导响应元件的生物学功能,这将为基因表达调控的研究及抗病育种提供重要的理论依据。1.用PCR法制备了Pib全长启动子-3572～2bp(3575bp)和3个5’端缺失片段-2692bp～2bp(2695bp)、-1335bp～2bp(1338bp)、-761bp～2bp(764bp),得到4个不同长度的Pib启动子分别置换掉双元质粒pCAMBIA1301中gus基因上游的35S构建为重组质粒,构建了pNAR901、pNAR902、pNAR903和pNAR904四个植物表达载体,重组质粒经过酶切鉴定,用农杆菌冻融转化法转化入农杆菌菌株EHA101中。2.利用农杆菌介导法,将pib全长启动子及其5’端不同缺失体片段驱动gus基因的四个重组双元载体pNAR901、pNAR902、pNAR903和pNAR904和CaMV35S启动子驱动gus基因的pCAMBIA1301对照质粒分别转化粳稻R109。经农杆菌侵染、潮霉素筛选、分化、壮苗,获得pNAR901转化植株22株、pNAR902转化植株27株、pNAR903转化植株20株、pNAR904转化植株30株,pCAMBIA1301转化植株5株,阳性率达到74.8%,对转基因植株进行PCR, Southern blot和潮霉素抗性鉴定,结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中,且外源基因大部分以单拷贝插入植物基因组。3.以Pib全长启动子及3个5’端不同长度缺失的Pib启动子片段驱动gus基因的水稻转基因植株为材料,对转基因水稻中GUS活性进行的蛋白质水平和mRNA水平的定性和定量分析结果表明,全长Pib启动子(-3572～2bp,pNAR901)启动活性最强,茉莉酸或乙烯诱导6h后,其驱动下的gus基因在转基因植株各部组织中的表达量明显上升。而-3572～-2692bp区段序列缺失后不但Pib启动子启动活性显著降低而且也丧失了对茉莉酸和乙烯的诱导活性。pNAR902(-2692～2bp)与pNAR903(-1335～2bp)和pNAR904(-761～2bp)中的Pib启动子序列的缺失长度相差达2倍和3倍以上,但其对茉莉酸和乙烯的诱导响应没有区别。这些结果显示这三个Pib启动子缺失体构建中,其共同的缺失序列即-3572bp～-2692bp区域是Pib启动子的乙烯和茉莉酸诱导响应的必需区域。软件检索证实,Pib启动子序列中只在上述共同缺失区段之内的-2722bp处有一个GCCGCC基序。本文报导的转基因试验表明,GCCGCC基序可能是Pib基因中有关乙烯和茉莉酸诱导响应的顺式分子元件。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-11缩略语 11-13第一章文献综述 13-33 第一节水稻稻瘟病的研究 13-21 1 稻瘟病研究的历史 14 2 稻瘟病菌的生理特性 14 3 稻瘟病的发病症状及流行规律 14-15 4 稻瘟病菌侵染与危害 15-16 5 抗稻瘟病基因的研究 16-21 5.1 稻瘟病抗性基因的遗传分析 16-17 5.2 稻瘟病抗性基因的定位和克隆 17-19 5.3 pib基因的克隆及研究 19-21 第二节水稻遗传转化研究 21-28 1 水稻遗传转化的方法 21-24 1.1 农杆菌介导法(Agrobacterium mediated) 21-22 1.2 基因枪法(Particle bombardment,Particlegun) 22-23 1.3 PEG法(Polyethylene Glycol) 23 1.4 电激法(Electropo ration) 23 1.5 花粉管通道法(pollen tube-pathway transformation) 23-24 1.6 其他转化方法 24 2 水稻遗传转化受体系统 24-25 2.1 原生质体 24-25 2.2 胚性愈伤组织和悬浮细胞 25 2.3 组织器官 25 3 水稻遗传转化中报告和标记基因的研究 25-26 3.1 水稻转化过程中的报告基因 25-26 3.2 水稻转化过程中的标记基因 26 4 水稻遗传转化过程中存在的问题与展望 26-28 4.1 基因沉默 26-27 4.2 选择标记基因的去除 27 4.3 外源基因在转基因植物中的最佳表达及其遗传稳定性 27-28 4.4 水稻遗传转化在水稻育种中的应用 28 第三节植物启动子的研究 28-33 1 植物启动子的结构 28-29 2 植物启动子的类型 29-32 2.1 组成型启动子 29-30 2.2 组织特异型启动子 30 2.3 诱导型启动子 30-32 2.3.1 非生物胁迫诱导型启动子 30-31 2.3.2 生物胁迫诱导型启动子 31 2.3.3 激素诱导型启动子 31-32 3 植物启动子的功能和结构研究 32-33第二章 pib基因启动子的5’端缺失体驱动gus基因植物表达载体的构建 33-45 1 材料和方法 33-38 1.1 材料 33-34 1.2 方法 34-38 2 结果与分析 38-45 2.1 对双元载体pCAMBIA1301的分析 38-39 2.2 载体的构建 39-43 2.3 双元载体转化农杆菌EHA101 43-45第三章农杆菌介导的转基因植株的获得 45-57 1 材料与方法 45-52 1.1 实验材料 45-48 1.2 实验方法 48-52 2 结果与分析 52-57 2.1 转基因水稻植株的获得 52-53 2.2 转基因水稻叶片的抗潮霉素鉴定 53-55 2.3 转基因植株的PCR鉴定 55 2.4 转基因植株的Southern blot鉴定 55-57第四章 Pib启动子中乙烯和茉莉酸响应元件的转基因分析 57-69 1 材料和方法 58-61 1.1 实验材料 58-59 1.2 实验方法 59-61 2 结果与分析 61-67 2.1 Pib全长启动子-gus构建转基因愈伤的组织化学检测 61-63 2.2 Pib基因启动子中茉莉酸和乙烯响应区域 63-67 3 讨论 67-69全文结论 69-71参考文献 71-81附录 81-83攻读硕士期间发表的论文 83-85致谢 85

水稻Pib启动子中乙烯和茉莉酸响应元件的转基因分析

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