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J亚型禽白血病病毒抗体检测方法的建立及LTR体外启动活性分析

作　者: 张伟伟
导　师: 刘光清
学　校: 浙江师范大学
专　业: 动物学
关键词: 禽白血病病毒 ALV-J 囊膜糖蛋白 gp85 LTR 间接ELISA 启动子
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J, ALV-J)自上个世纪发现以来,以垂直和水平两种传播形式在世界各国肉种鸡及商品肉用型鸡群中广泛流行,以诱发肿瘤、引起肉种鸡死亡和消瘦为主要特征,同时还能导致机体发生免疫抑制,给养禽业带来巨大的经济损失。近年来,该病在我国养鸡业中呈现流行趋势,其致瘤宿主谱系已扩展至不易发生肿瘤的商品蛋鸡。鉴于目前尚无有效的药物或疫苗可供使用,通过淘汰ALV-J抗体阳性鸡群,减少垂直传播是当前净化鸡群感染禽白血病的唯一手段。因此,建立ALV-J抗体的特异性检测方法,对防制该病流行、开展种群净化具有重要意义。本论文即利用原核表达系统高效表达了ALV-J的囊膜糖蛋白基因,并以纯化蛋白为抗原建立了检测ALV-J抗体的间接ELISA方法。首先,根据ALV-J原型株HPRS103基因序列设计了一对引物,特异性扩增出囊膜糖蛋白基因(gp85),并构建了原核表达重组质粒pET-gp85,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导获得高效表达,分子量约为37kD。蛋白免疫电泳检测(Western Blot)结果表明,表达蛋白具有良好的免疫原性。然后,本研究以纯化后的GP85蛋白作为抗原,初步建立了检测ALV-J抗体的间接ELISA检测方法,并对部分鸡场的ALV-J疑似血清样本进行了检测。结果表明,上海某种鸡场的血清阳性率为100%、安徽某种鸡场血清阳性率为85.7%(6/7)、安徽某青壳蛋鸡场血清阳性检出率为53.8%(7/13),提示ALV-J感染在我国部分规模养鸡场十分严重。为了探讨ALV-J在鸡群中垂直传播的分子机制,为临床防制ALV-J感染提供理论依据,本论文还对ALV-J基因组的长末端重复序列(LTR)的转录调控功能进行了研究。首先,将LTR基因插入含有萤光素酶报告基因的pGL3-Basic载体中,获得pGL3-LTR重组质粒；此外,还构建了缺失LTR不同区段(U5、U3和R区)的重组质粒。然后转染DF1细胞,通过检测萤光素酶的表达,研究LTR的启动子活性及其功能性区域。结果表明,LTR具有较高的启动报告基因转录的功能,其中的U3区是LTR的启动子活性区,U5区则可能存在负调控功能,本研究为进一步了解ALV-J的复制调控机制和分子致病机理奠定了基础。

全文目录

摘要 4-6ABSTRACT 6-10符号说明 10-12第一部分文献综述 12-35 第一章 ALV-J研究进展 12-35 1 ALV-J病毒概述 12-13 2 J亚型禽白血病毒研究进展 13-34 2.1 ALV-J病原学 13-21 2.2 病毒变异与重组 21-23 2.3 病毒致病机理与组织嗜性 23-25 2.4 病毒引起的免疫抑制 25-27 2.5 ALV-J流行病学 27-30 2.6 病毒的检测 30-33 2.7 病毒的防治 33-34 3 课题研究的意义 34-35第二部分研究报告 35-68 第二章 ALV-J囊膜糖蛋白基因的表达和初步应用 35-56 引言 35-36 1 材料和方法 36-47 1.1 材料与试剂 36-37 1.2 实验方法 37-47 2 结果 47-53 2.1 目的基因片段的扩增 47-48 2.2 重组质粒的酶切鉴定 48 2.3 重组蛋白的表达、纯化与鉴定 48-51 2.4 Western Blot检测兔抗血清 51-52 2.5 ALV-J抗体ELISA检测 52-53 3 讨论 53-56 第三章 J亚型禽白血病病毒 LTR体外启动活性分析 56-68 引言 56 1 材料、方法 56-62 1.1 材料 56-58 1.2 方法 58-62 2 结果 62-66 2.1 pGL3-LTR及其系列缺失突质粒 62 2.2 PCR扩增U3、RU5和重组质粒酶切鉴定 62-63 2.3 重组质粒的定量和转染 63 2.4 萤光素酶检测结果 63-66 3. 讨论 66-68结论 68-69参考文献 69-81致谢 81-83攻读学位期间获得的研究成果 83-84

J亚型禽白血病病毒抗体检测方法的建立及LTR体外启动活性分析

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