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百脉根结瘤信号通路蛋白NSP1/NSP2相互作用的研究

作　者: 胡晓晶
导　师: 张忠明
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 百脉根结瘤因子信号转导结瘤信号通路蛋白酵母双杂交
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

根瘤菌与豆科植物能特异地形成共生体-根瘤。这种共生关系的建立涉及到低等微生物与其宿主植物之间复杂的信号识别、基因表达调控、分子间相互作用等过程。百脉根是研究共生固氮体系的模式豆科植物之一,对其根瘤菌结瘤因子信号转导途径和作用机制的研究,将有助于揭示根瘤菌与豆科植物共生关系建立和共生体形成的奥秘。百脉根结瘤信号通路NSP1和NSP2是根瘤菌共生信号转导途径中关键的信号蛋白,都属于GRAS家族转录因子,位于CCaMK (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase)下游,并受其调控。本研究的侧重点在于探究NSP1与NSP2间是否存在相互作用,相互作用区段以及检测NSP1基因是否具有结合启动子的能力以及行使此功能的区段,进而揭示NSP1、NSP2在结瘤因子信号传导途径的调控机制。其研究结果如下：1.构建了一系列nsp1和nsp2缺失突变体,利用酵母双杂交系统研究了百脉根结瘤信号通路NSP1和NSP2蛋白间的相互作用。结果表明NSP1具有与NSP2相互作用的功能,而且NSP2单独的LHR1结构域(105-186氨基酸)则能与NSP1相互作用,说明NSP1与NSP2在行使功能时可能形成异源二聚体。2.构建了一系列在大肠杆菌中表达的缺失突变体,并表达和纯化缺失不同结构域的截短蛋白,利用pull-down和western印迹转移技术进行了体外蛋白质相互作用。结果表明,NSP1缺失LHR1、VHIID两个结构域后仍具有与NSP2蛋白相互作用的功能,而缺失LHRII区段后则不能相互作用,说明NSP1的LHRII区段是两蛋白间相互作用所必需的。3.利用凝胶阻滞(EMSA)实验,初步检测了NSP1是否结合启始结瘤基因NIN的启动子的功能,但没有得到理想的实验结果,其原因可能是所用的DNA片段太长(500bp),在EMSA凝胶上只见到一些弥散的DNA带,因此该结果需要进一步证实。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-9
1 前言  9-18
  1.1 研究背景  9
  1.2 豆科植物与根瘤菌之间的分子对话  9-10
  1.3 豆科植物对根瘤菌结瘤因子的辩认  10-11
  1.4 结瘤因子的信号转导  11-13
  1.5 结瘤信号通路蛋白  13-15
  1.6 研究蛋白质之间以及蛋白与DNA之间相互作用的方法  15-16
    1.6.1 酵母双杂交技术  15-16
    1.6.2 pull-down和western印迹转移技术  16
    1.6.3 凝胶阻滞(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)  16
  1.7 本研究的目的、意义、技术路线  16-18
2 材料与方法  18-26
  2.1 材料  18-20
    2.1.1 菌株与质粒  18
    2.1.2 分子生物学试剂  18
    2.1.3 培养基  18-19
    2.1.4 贮存液和缓冲液配方  19-20
  2.2 方法  20-26
    2.2.1 用PCR扩增出序列已知的基因  20
    2.2.2 NSP全长及缺失突变体的表达质粒的构建  20-21
    2.2.3 酵母感受态细胞的制备及转化  21
    2.2.4 菌落PCR  21
    2.2.5 酵母体内检测蛋白间的相互作用  21-22
    2.2.6 利用ONPG作为底物定量检测β-半乳糖苷酶活性  22
    2.2.7 靶蛋白诱导表达  22-23
    2.2.8 靶蛋白诱导纯化  23-24
    2.2.9 Western Blotting技术检测蛋白间的相互作用  24
    2.2.10 凝胶阻滞(EMSA)实验  24-26
3 结果与分析  26-34
  3.1 NSP及其缺失突变体表达质粒的构建  26-27
  3.2 百脉根NSP1、NSP2及其缺失突变体融合蛋白的诱导表达  27-28
  3.3 百脉根NSP1、NSP2及其缺失突变体融合蛋白的纯化  28-29
  3.4 百脉根NSP1与NSP2蛋白在酵母体内的相互作用  29-31
  3.5 NSP1与NSP2相互作用结构域的鉴定  31-33
  3.6 NSP1结合启动子DNA能力的鉴定  33-34
4 总结与讨论  34-37
  4.1 总结  34-35
  4.2 讨论  35-37
参考文献  37-43
致谢  43-44
论文发表情况  44

百脉根结瘤信号通路蛋白NSP1/NSP2相互作用的研究

内容摘要

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