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酵母双杂交筛选禽流感病毒PA相互作用蛋白的研究

作 者: 王少蕾
导 师: 张春枝;许龙
学 校: 大连工业大学
专 业: 发酵工程
关键词: 禽流感病毒 H5N1 PA 表达 相互作用 酵母双杂交
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


禽流感病毒是正黏病毒科的主要成员,是单股负链分节段的RNA病毒,依赖自身的RNA聚合酶复合体催化其基因组在宿主细胞核中进行转录和复制。目前多种研究报道表明禽流感病毒能够跨种传播,给人类健康造成了巨大的威胁,因此加强禽流感病毒致病机制的研究显得格外重要。聚合酶酸性蛋白(PA)是RNA聚合酶复合体3个亚基中的重要角色,它不但参与病毒复制、病毒RNA转录、病毒粒子组装等多种病毒活动过程,还具有核酸内切酶活性和蛋白酶活性。本文以高致病性禽源H5N1亚型禽流感病毒PA原核表达相互作用蛋白筛选为切入点,对PA蛋白的功能进行了初步研究。首先,构建了17个PA突变体的表达载体,SDS-PAGE电泳及Western blot分析突变体的表达丰度,证明PA基因的61-120bp和325-426bp可能是影响PA蛋白表达的两个重要区域,同时N端缺失长度在143-408个氨基酸残基之间的9个突变体在大肠杆菌中获得高表达。为制备各片段的特异性抗血清、验证蛋白的相互作用区域、表达得到全长PA蛋白奠定基础。其次,采用MATCHMAKER GAL4 Two-hybrid System 3(clontech公司),以H5N1型病毒的PA为诱饵,筛选人肝cDNA文库相互作用蛋白,得到8个蛋白与PA相互作用,分别为GPATCH8、GPR89A、ADH1A、ADH1C、TTR、PMSA、LBP、ETFA,并在酵母内验证这6个蛋白与H5N1型病毒的PA有相互作用。第三,根据GenBank相关序列资料设计特异引物,通过PCR的方法,扩增得到GPR89A、ADH1C、TTR、PMSA、LBP、ETFA6个全长基因。构建了6个蛋白的原核及真核表达载体,Western blot检测,除GPR89A外其余蛋白在肺腺癌细胞A549中有表达。为后续免疫共沉淀试验进一步验证蛋白相互作用奠定基础。本研究发现了影响PA原核表达的区域,并筛选出8种PA的相互作用蛋白,进一步揭示了禽流感病毒致病过程中PA蛋白的功能,促进了对流感病毒致病机理的认识,为禽流感病毒疫苗和新型抗病毒药物的研究提供依据。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 综述  10-17
  1.1 引言  10
  1.2 禽流感病毒的基本特点  10-12
    1.2.1 禽流感病毒的组成  10-11
    1.2.2 禽流感病毒的多型性  11
    1.2.3 禽流感病毒的形态结构  11-12
    1.2.4 禽流感病毒的抗性  12
  1.3 禽流感病毒的蛋白功能  12-14
    1.3.1 表面糖蛋白血凝素  12
    1.3.2 表面糖蛋白神经氨酸酶  12-13
    1.3.3 核蛋白  13
    1.3.4 RNA聚合酶  13
    1.3.5 基质蛋白  13-14
    1.3.6 非结构蛋白  14
  1.4 禽流感病毒的复制  14-15
    1.4.1 病毒的脱壳  14
    1.4.2 病毒基因组的转录、复制  14-15
    1.4.3 病毒粒子的装配与释放  15
  1.5 禽流感病毒PA蛋白的研究进展  15-16
    1.5.1 PA蛋白的功能  15
    1.5.2 PA蛋白的结构  15-16
  1.6 本论文研究内容  16-17
第二章 H5N1型禽流感病毒PA突变体基因的克隆及原核表达  17-29
  2.1 材料与方法  17-22
    2.1.1 材料  17-20
      2.1.1.1 细菌菌株  17
      2.1.1.2 载体及质粒  17
      2.1.1.3 主要试剂  17-18
      2.1.1.4 溶液配制  18-19
      2.1.1.5 主要仪器设备  19-20
    2.1.2 方法  20-22
      2.1.2.1 PA缺失突变体基因的克隆  20
      2.1.2.2 H5N1型病毒的PA缺失突变体的原核表达  20-21
      2.1.2.2 重组蛋白的Western-blotting检测  21-22
  2.2 结果  22-26
    2.2.1 PA缺失突变体基因的克隆  22-23
    2.2.2 H5N1型病毒PA缺失突变体的表达  23-25
    2.2.3 重组蛋白的Western-blotting检测  25-26
  2.3 讨论  26-28
  2.4 小结  28-29
第三章 PA相互作用蛋白的筛选  29-49
  3.1 材料与方法  29-36
    3.1.1 材料  29-32
      3.1.1.1 菌株及质粒  29
      3.1.1.2 引物  29-30
      3.1.1.3 酶类、试剂及试剂盒  30
      3.1.1.4 溶液配制  30-32
    3.1.2 方法  32-36
      3.1.2.1 酵母双杂交流程  32-33
      3.1.2.2 酵母双杂交系统的建立  33-34
        3.1.2.2.1 杂交控制试验  33
        3.1.2.2.2 酵母感受态细胞的制备  33-34
        3.1.2.2.3 酵母的转化  34
        3.1.2.2.4 诱饵质粒毒性及自激活性的验证  34
      3.1.2.3 人肝组织cDNA文库的筛选  34
      3.1.2.4 阳性质粒的分离  34-35
      3.1.2.5 插入片段的PCR扩增  35
      3.1.2.6 相互作用蛋白的验证  35
      3.1.2.7 阳性克隆cDNA的测序及其序列同源性检索  35-36
  3.2 结果  36-45
    3.2.1 诱饵蛋白的毒性及转录自激活性分析  36
    3.2.2 文库筛选结果  36-37
    3.2.3 插入片段的PCR分析  37
    3.2.4 回交验证相互作用  37-38
    3.2.5 阳性克隆的生物信息学分析  38-45
  3.3 讨论  45-48
  3.4 小结  48-49
第四章 相互作用蛋白全长基因的克隆及表达载体构建  49-61
  4.1 材料与方法  49-54
    4.1.1 材料  49-50
      4.1.1.1 细胞系、菌株  49
      4.1.1.2 质粒载体  49
      4.1.1.3 主要试剂  49-50
      4.1.1.4 主要仪器  50
    4.1.2 方法  50-54
      4.1.2.1 引物设计  50-51
      4.1.2.2 相互作用蛋白全长基因的PCR扩增  51-52
      4.1.2.3 PCR产物的克隆  52-53
        4.1.2.3.1 PCR产物回收  52
        4.1.2.3.2 连接及转化  52-53
        4.1.2.3.3 质粒的提取及测序  53
      4.1.2.4 真核表达载体的构建  53-54
      4.1.2.5 原核表达载体的构建  54
      4.1.2.6 重组质粒在肺腺癌细胞A549中的表达  54
        4.1.2.6.1 细胞转染  54
        4.1.2.6.2 蛋白表达的Western-blotting检测  54
  4.2 结果与讨论  54-59
    4.2.1 相互作用蛋白全长基因的PCR扩增  54-57
    4.2.2 真核表达载体的构建  57-58
    4.2.3 原核表达载体的构建  58
    4.2.4 重组质粒在肺腺癌细胞A549中的表达  58-59
  4.3 讨论  59-60
  4.4 小结  60-61
第五章 结论  61-62
参考文献  62-67
致谢  67

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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