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酵母双杂交筛选禽流感病毒PA相互作用蛋白的研究
作 者: 王少蕾
导 师: 张春枝;许龙
学 校: 大连工业大学
专 业: 发酵工程
关键词: 禽流感病毒 H5N1 PA 表达 相互作用 酵母双杂交
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要
禽流感病毒是正黏病毒科的主要成员,是单股负链分节段的RNA病毒,依赖自身的RNA聚合酶复合体催化其基因组在宿主细胞核中进行转录和复制。目前多种研究报道表明禽流感病毒能够跨种传播,给人类健康造成了巨大的威胁,因此加强禽流感病毒致病机制的研究显得格外重要。聚合酶酸性蛋白(PA)是RNA聚合酶复合体3个亚基中的重要角色,它不但参与病毒复制、病毒RNA转录、病毒粒子组装等多种病毒活动过程,还具有核酸内切酶活性和蛋白酶活性。本文以高致病性禽源H5N1亚型禽流感病毒PA原核表达及相互作用蛋白筛选为切入点,对PA蛋白的功能进行了初步研究。首先,构建了17个PA突变体的表达载体,SDS-PAGE电泳及Western blot分析突变体的表达丰度,证明PA基因的61-120bp和325-426bp可能是影响PA蛋白表达的两个重要区域,同时N端缺失长度在143-408个氨基酸残基之间的9个突变体在大肠杆菌中获得高表达。为制备各片段的特异性抗血清、验证蛋白的相互作用区域、表达得到全长PA蛋白奠定基础。其次,采用MATCHMAKER GAL4 Two-hybrid System 3(clontech公司),以H5N1型病毒的PA为诱饵,筛选人肝cDNA文库相互作用蛋白,得到8个蛋白与PA相互作用,分别为GPATCH8、GPR89A、ADH1A、ADH1C、TTR、PMSA、LBP、ETFA,并在酵母内验证这6个蛋白与H5N1型病毒的PA有相互作用。第三,根据GenBank相关序列资料设计特异引物,通过PCR的方法,扩增得到GPR89A、ADH1C、TTR、PMSA、LBP、ETFA6个全长基因。构建了6个蛋白的原核及真核表达载体,Western blot检测,除GPR89A外其余蛋白在肺腺癌细胞A549中有表达。为后续免疫共沉淀试验进一步验证蛋白相互作用奠定基础。本研究发现了影响PA原核表达的区域,并筛选出8种PA的相互作用蛋白,进一步揭示了禽流感病毒致病过程中PA蛋白的功能,促进了对流感病毒致病机理的认识,为禽流感病毒疫苗和新型抗病毒药物的研究提供依据。
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全文目录
摘要 4-5 Abstract 5-10 第一章 综述 10-17 1.1 引言 10 1.2 禽流感病毒的基本特点 10-12 1.2.1 禽流感病毒的组成 10-11 1.2.2 禽流感病毒的多型性 11 1.2.3 禽流感病毒的形态结构 11-12 1.2.4 禽流感病毒的抗性 12 1.3 禽流感病毒的蛋白功能 12-14 1.3.1 表面糖蛋白血凝素 12 1.3.2 表面糖蛋白神经氨酸酶 12-13 1.3.3 核蛋白 13 1.3.4 RNA聚合酶 13 1.3.5 基质蛋白 13-14 1.3.6 非结构蛋白 14 1.4 禽流感病毒的复制 14-15 1.4.1 病毒的脱壳 14 1.4.2 病毒基因组的转录、复制 14-15 1.4.3 病毒粒子的装配与释放 15 1.5 禽流感病毒PA蛋白的研究进展 15-16 1.5.1 PA蛋白的功能 15 1.5.2 PA蛋白的结构 15-16 1.6 本论文研究内容 16-17 第二章 H5N1型禽流感病毒PA突变体基因的克隆及原核表达 17-29 2.1 材料与方法 17-22 2.1.1 材料 17-20 2.1.1.1 细菌菌株 17 2.1.1.2 载体及质粒 17 2.1.1.3 主要试剂 17-18 2.1.1.4 溶液配制 18-19 2.1.1.5 主要仪器设备 19-20 2.1.2 方法 20-22 2.1.2.1 PA缺失突变体基因的克隆 20 2.1.2.2 H5N1型病毒的PA缺失突变体的原核表达 20-21 2.1.2.2 重组蛋白的Western-blotting检测 21-22 2.2 结果 22-26 2.2.1 PA缺失突变体基因的克隆 22-23 2.2.2 H5N1型病毒PA缺失突变体的表达 23-25 2.2.3 重组蛋白的Western-blotting检测 25-26 2.3 讨论 26-28 2.4 小结 28-29 第三章 PA相互作用蛋白的筛选 29-49 3.1 材料与方法 29-36 3.1.1 材料 29-32 3.1.1.1 菌株及质粒 29 3.1.1.2 引物 29-30 3.1.1.3 酶类、试剂及试剂盒 30 3.1.1.4 溶液配制 30-32 3.1.2 方法 32-36 3.1.2.1 酵母双杂交流程 32-33 3.1.2.2 酵母双杂交系统的建立 33-34 3.1.2.2.1 杂交控制试验 33 3.1.2.2.2 酵母感受态细胞的制备 33-34 3.1.2.2.3 酵母的转化 34 3.1.2.2.4 诱饵质粒毒性及自激活性的验证 34 3.1.2.3 人肝组织cDNA文库的筛选 34 3.1.2.4 阳性质粒的分离 34-35 3.1.2.5 插入片段的PCR扩增 35 3.1.2.6 相互作用蛋白的验证 35 3.1.2.7 阳性克隆cDNA的测序及其序列同源性检索 35-36 3.2 结果 36-45 3.2.1 诱饵蛋白的毒性及转录自激活性分析 36 3.2.2 文库筛选结果 36-37 3.2.3 插入片段的PCR分析 37 3.2.4 回交验证相互作用 37-38 3.2.5 阳性克隆的生物信息学分析 38-45 3.3 讨论 45-48 3.4 小结 48-49 第四章 相互作用蛋白全长基因的克隆及表达载体构建 49-61 4.1 材料与方法 49-54 4.1.1 材料 49-50 4.1.1.1 细胞系、菌株 49 4.1.1.2 质粒载体 49 4.1.1.3 主要试剂 49-50 4.1.1.4 主要仪器 50 4.1.2 方法 50-54 4.1.2.1 引物设计 50-51 4.1.2.2 相互作用蛋白全长基因的PCR扩增 51-52 4.1.2.3 PCR产物的克隆 52-53 4.1.2.3.1 PCR产物回收 52 4.1.2.3.2 连接及转化 52-53 4.1.2.3.3 质粒的提取及测序 53 4.1.2.4 真核表达载体的构建 53-54 4.1.2.5 原核表达载体的构建 54 4.1.2.6 重组质粒在肺腺癌细胞A549中的表达 54 4.1.2.6.1 细胞转染 54 4.1.2.6.2 蛋白表达的Western-blotting检测 54 4.2 结果与讨论 54-59 4.2.1 相互作用蛋白全长基因的PCR扩增 54-57 4.2.2 真核表达载体的构建 57-58 4.2.3 原核表达载体的构建 58 4.2.4 重组质粒在肺腺癌细胞A549中的表达 58-59 4.3 讨论 59-60 4.4 小结 60-61 第五章 结论 61-62 参考文献 62-67 致谢 67
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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