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应用酵母双杂交技术筛选与香鱼LECT2互作的蛋白

作　者: 杨红艳
导　师: 陈炯
学　校: 宁波大学
专　业: 水产养殖
关键词: 酵母双杂交 LECT2 转铁蛋白 C型凝集素受体
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

白细胞衍生趋化因子(leukocyte cell-derived chemotaxin 2, LECT2)是一个多功能的蛋白质,涉及到细胞生长、分化、损伤修复及免疫等过程并且参与了免疫应答防御机制的调控,但其作用机制尚不明确。本研究以香鱼LECT2为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选与之互作的蛋白,通过蛋白之间的互作关系,解析鱼类LECT2的生理功能及其作用机制。本研究首先从香鱼肝脏cDNA文库中获得LECT2基因,其全长cDNA为547个核苷酸,3’末端具有polyA尾,单一大开读框编码一个由156个氨基酸组成的分子量为17 kDa的蛋白质。以香鱼LECT2 (FM253748)为诱饵,应用酵母双杂交技术从香鱼肝脏cDNA文库(独立克隆为2.5×106)中筛选到9个候选基因,经鉴定其中7个为转铁蛋白(transferrin, Tf),其余2个为C型凝集素受体(C-type lectin receptor, aCLR)。通过5’-Race技术获得aTf全长cDNA序列(FM875933),该cDNA序列全长2246个核苷酸,3’末端具有polyA尾,开放阅读框由693个氨基酸组成,编码蛋白分子量为75.9 kDa。序列分析表明,aTf(185-289)包括两个铁结合残基(Tyr197和His253),位于aTf的N末端。酵母体内互作实验表明,全长aTf与aLECT2之间仍存在互作。缺失实验表明,aTf(185-289)区段和aLECT2信号肽都不参与两者间的互作。此外,其他物种,如大黄鱼、小鼠,LECT2和Tf之间也互作,而且同一物种之间互作,不同物种之间不互作。另据文献报道,Tf-LECT2的互作可能与机体抵御病原侵染有关。aCLR cDNA序列(FN396582)全长1265个核苷酸,3’末端具有polyA尾,开放阅读框编码一个由156个氨基酸组成的分子量为29.30 kDa的蛋白质,与大西洋鲑C-type lectin受体A基因同源性最高。酵母体内互作实验表明,全长aCLR与aLECT2之间仍存在互作。缺失实验结果表明,aCLR通过C型凝集素结构域(CTLD)与LECT2进行互作。由于鱼类CLR的CTLD与哺乳动物树突状细胞表面特异性表面特异性非整联蛋白受体(DC-SIGN)同源性很高。另据实验表明,小鼠DC-SIGN与LECT2之间也存在互作,这暗示血清中的LECT2可能会对膜表面的DC-SIGN产生影响。根据以上结果,我们推测香鱼CLR可能通过与LECT2互作,参与了LECT2趋化嗜中性粒细胞的信号转导途径。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-11
1 酵母双杂交在水产动物研究中的应用  11-23
  1.1 酵母双杂交技术的原理  11-12
  1.2 酵母双杂交的优缺点  12-13
    1.2.1 特点与优点  12-13
    1.2.2 酵母双杂交技术的局限性  13
  1.3 酵母双杂交技术的应用  13-15
    1.3.1 发现新蛋白或蛋白的新功能  13-14
    1.3.2 灵敏地检测或验证蛋白－蛋白的相互作用  14
    1.3.3 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点，寻找基因治疗中的多肽类药物  14
    1.3.4 在蛋白质组学研究中的应用：可利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map)  14
    1.3.5 研究蛋白间发生相互作用的重要位点  14-15
  1.4 酵母双杂交技术在水产动物研究中的应用  15-20
    1.4.1 在水产动物免疫学研究中的应用  15-16
    1.4.2 在水产动物生长发育研究中的应用  16-18
    1.4.3 在水产动物生理功能研究中的应用  18
    1.4.4 在水产动物病原与寄主互作研究中的应用  18-20
  1.5 展望  20-23
2 材料与方法  23-36
  2.1 试剂与仪器  23
    2.1.1 试剂  23
    2.1.2 仪器  23
  2.2 材料  23-24
    2.2.1 实验动物  23-24
    2.2.2 菌株与载体质粒  24
  2.3 方法  24-36
    2.3.1 LECT2 的克隆与测序  24-25
    2.3.2 诱饵载体的构建  25-28
    2.3.3 酵母cDNA 文库构建  28-33
    2.3.4 筛选与pGBKT7-aLECT2 互作的蛋白  33-35
    2.3.5 互作验证  35-36
3 香鱼LECT2 基因的克隆及酵母双杂交诱饵载体的构建、鉴定与表达  36-44
  3.1 前言  36
  3.2 结果  36-42
    3.2.1 香鱼LECT2 基因cDNA 序列的获得  36-37
    3.2.2 序列分析  37-38
    3.2.3 香鱼LECT2 基因在各组织中的表达  38-39
    3.2.4 酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-aLECT2 的构建  39-40
    3.2.5 pGBKT7-aLECT2 在感受态酵母菌中的表达  40-41
    3.2.6 pGBKT7-aLECT2 对酵母报告基因的自激活验证  41
    3.2.7 DNA-BD/aLECT2 融合蛋白对酵母AH109 的毒性检测  41-42
  3.3 讨论  42-44
4 香鱼LECT2 与Tf 之间的互作研究  44-53
  4.1 前言  44
  4.2 结果  44-51
    4.2.1 应用酵母双杂交技术筛选与aLECT2 互作蛋白  44-49
    4.2.2 鉴定aLECT2 和Tf 互作的结构域  49-51
  4.3 讨论  51-53
5 香鱼C 型凝集素受体与LECT2 之间的互作研究  53-61
  5.1 前言  53
  5.2 结果  53-59
    5.2.1 应用酵母双杂交技术筛选与aLECT2 互作的蛋白  53-57
    5.2.2 鉴定aLECT2 和CLR 互作的结构域  57-59
  5.3 讨论  59-61
6 结论  61-62
参考文献  62-72
在学研究成果  72-73
资助项目  73-74
致谢  74

应用酵母双杂交技术筛选与香鱼LECT2互作的蛋白

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