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Tec激酶区作用蛋白RAI 16的功能和分化调控机理初步研究

作　者: 雒喜忠
导　师: 王阁
学　校: 第三军医大学
专　业: 肿瘤学
关键词: Tec蛋白酵母双杂交 RAI16蛋白生物信息学肝细胞癌诱导分化表达纯化
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景和目的:肿瘤是一种多基因、多步骤、多因素、多网络的病理机制复杂的疾病,细胞分化障碍是肿瘤形成的本质,利用某些化合物诱导肿瘤细胞分化为正常细胞或近似正常细胞的肿瘤的诱导分化治疗是继手术、放疗、化疗后的新的治疗模式,已成为研究的“热点”。Tec(tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma)是一种存在于胞质内的非受体型蛋白酪氨酸激酶,是肝干细胞和肝细胞增殖、分化、凋亡信号转导途径中关键的蛋白激酶连接分子。我们在前期工作中以Tec激酶结构域(KD)作为“钓饵”蛋白,利用酵母双杂交技术筛选构建于转录激活结构域(AD)载体的人胎肝cDNA文库,经营养缺陷选择、诱导筛选及初步鉴定,发现并确证了一个新的阳性克隆。筛库所得基因片段经测序和BLAST比对分析,无同源性序列,确定为RAI16(Homo sapiens retinoic acid induced 16)基因,已被GeneBank收录(编号为BC052237),组织来源为脑Ⅳ型星状细胞瘤,其编码蛋白为人视黄酸诱导蛋白16。进而以RAI16蛋白为切入点,利用相关的生物信息学站点及计算机软件,对RAI16进行生物信息学分析,从中获得其编码蛋白质结构方面的重要信息,从而根据结构预测其功能。生物信息学分析提示,RAI16蛋白含6个PKC磷酸化结合位点,8个CK2磷酸化结合位点,3个酪氨酸(Tyr)磷酸化结合位点, 5个豆蔻酰化位点,2个酰胺化位点,1个ATP/GTP-结合位点、无跨膜区结构域,具有一段由31个氨基酸组成的信号肽,且其切割位点位于30～31aa之间,因此推测RAI16蛋白可能为RA信号通路中一类胞浆内重要的“新”信号蛋白分子。关于RAI16文献报道很少,功能研究报告更是空白,从其命名知晓,为一种RA诱导蛋白。由于诱导分化剂相关的信号转导过程是揭示其作用机理的关键,结合RA在肿瘤细胞分化中的突出作用和RAI16蛋白的功能的“未知性”,我们选择肝癌细胞为对象,将课题切入点定位于“Tec作用蛋白RAI16的新功能和分化调控机理研究”上,以酵母双杂交系统筛选中Tec酪氨酸激酶与RAI16蛋白相互作用的现象为线索,从肝癌细胞诱导分化和胞内信号转导途径的角度,通过抗体制备、真核表达载体和腺病毒载体的构建及表达检测、免疫组化、激光共聚焦分析、Northern blotting、Western blotting、MTT、流式细胞仪(FCM)检测、划痕实验、Transwell细胞迁移和Metrigel细胞侵袭实验等多种方法明确RAI16的表达谱和亚细胞定位,分析RAI16在肝再生、肝癌形成和ATRA对肝癌细胞诱导分化过程中的作用,探讨RAI16对肝癌细胞诱导分化、细胞周期、细胞增殖与凋亡、迁移与侵袭力等多种生物学行为的影响,探索RAI16蛋白“新”功能,并进一步认识和阐明RAI16在RA诱导肝癌细胞分化的信号转导途径中的关键作用,本研究将为肿瘤细胞诱导分化信号转导分子机理的研究提供新思路和理论依据,为肝癌分子治疗提供新的作用靶点,为进一步研究其作用机制奠定基础。研究内容和方法1.用纯化的RAI16蛋白合成肽免疫新西兰大白兔,采用一种快速免疫法制备RAI16多克隆抗体,ELISA追踪检测抗体效价,Protein A亲和层析法纯化特异性IgG抗体,Western blot和免疫组化检测抗体的特性,初步检测RAI16在大鼠再生肝组织和肝癌组织中的表达,为进一步研究RAI16的功能提供抗体。2.以ATRA诱导人肝癌HepG2细胞后,流式细胞仪检测其对细胞周期、细胞增殖与凋亡的影响;提取总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western blot检测ATRA诱导后RAI16的表达情况,分析ATRA与RAI16在细胞诱导分化中的关系,为进一步探讨RAI16在诱导分化中的作用机理提供理论基础。3.以真核表达质粒pEGFP-C1为载体,从含有全长RAI16基因片段的质粒克隆模板中,利用PCR方法钓取目的基因,将目的基因与目的载体用EcoRI和XhoI分别进行酶切。纯化酶切产物后进行定向连接,构建pEGFP-C1-RAI16,经酶切及测序鉴定。采用激光共聚焦显微镜观察转染pEGFP-C1-RAI16后的亚细胞定位;Western blot分析检测其对HepG2细胞RAI16蛋白水平和诱导分化作用;利用MTT实验检测pEGFP-C1-RAI16质粒转染后对细胞增殖的影响。4.以真核表达质粒pDC315-EGFP为载体,从含有全长RAI16基因片段的质粒克隆模板中,利用PCR方法钓取RAI16基因,将其与真核表达载体pDC315-EGFP分别以EcoR I进行酶切。纯化酶切产物后进行定向连接,构建穿梭质粒pDC315-EGFP-RAI16。经测序鉴定后,利用AdMax腺病毒包装系统构建重组腺病毒Ad-RAI16,并进行包装、扩增、纯化和滴度测定;采用激光共聚焦显微镜观察感染Ad-RAI16后的亚细胞定位;通过Western blotting、MTT、流式细胞仪(FCM)检测、划痕实验、Transwell细胞迁移和Metrigel细胞侵袭实验等多种方法分析RAI16对肝癌细胞诱导分化、细胞周期、细胞增殖与凋亡、迁移与侵袭力等多种生物学行为的影响,进一步认识和阐明RAI16在RA诱导肝癌细胞分化的信号转导途径中的关键作用。研究结果1.成功制备了兔抗人RAI16多克隆抗体。ELISA检测显示该抗体的效价达到1:125 000,相对亲和力常数为10-5~10-6 M-1。Western blot和免疫组化提示该抗体能与RAI16蛋白特异性结合。RAI16在肝、心脏、食管、胃、脑、胰腺等多种组织中均有表达,而且在肝脏再生和肝癌形成过程中其表达呈上调趋势。2. ATRA诱导后RAI16的表达明显上调,并且呈时效性关系;MTT检测结果显示:ATRA能够抑制HepG2在体外的增殖,与对照组比较,诱导组细胞生长均2d开始明显受抑(P<0.05),组内不同处理天数之间有显著性差异(P<0.05)。流式细胞仪检测显示:ATRA能够促进肝癌细胞分化和凋亡,抑制细胞DNA合成,使其停滞于G1期。3. RAI16真核表达载体的构建及其生物学效应:经测序分析表明成功构建重组表达载体pEGFP-C1-RAI16。转染HepG2细胞发现RAI16主要定位于胞质内内质网等细胞器中,且能显著抑制细胞增殖和分化分子AFP、γ-GT的表达。4. RAI16腺病毒表达载体的构建及其生物学效应:经测序分析质粒表达检测表明成功构建重组表达腺病毒Ad-RAI16。感染HepG2细胞发现RAI16主要定位于胞质内内质网等细胞器中;能显著抑制细胞增殖、抑制分化分子AFP、γ-GT的表达和Wnt通路信号传导分子β-Catenin的表达;抑制细胞迁移,削弱细胞侵袭能力。结论1.成功制备兔抗人RAI16多克隆抗体并进行了特异性亲和纯化,抗体效价和纯度良好;Western blot和免疫组化显示制备抗体特异性良好。RAI16在多种组织中表达,并参与了肝再生和肝癌形成过程的调控。2. ATRA能够抑制肝癌细胞增殖,促进其分化和凋亡;能显著增强RAI16的表达。RAI16可能在ATRA的诱导分化过程发挥重要作用。3.成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-RAI16,RAI16蛋白定位于胞质内内质网等细胞器中;并具有抑制肝癌细胞增殖和促进分化的作用。4.成功构建重组腺病毒表达载体Ad-RAI16。进一步研究表明RAI16能够抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移,促进其分化和凋亡;可直接通过调控Wnt信号转导通路参与肝癌细胞的诱导分化。

全文目录

英文缩写索引  4-6
英文摘要  6-11
中文摘要  11-14
论文正文 Tec 激酶区作用蛋白RAI 16 的功能和分化调控机理初步研究  14-123
  前言  14-17
  第一部分 RAI 16 合成肽多克隆抗体的制备及初步应用  17-32
    材料与方法  17-25
    结果  25-30
    讨论  30-32
  第二部分 ATRA 诱导下RAI 16 在肝癌细胞HepG2 中的表达  32-53
    材料与方法  32-46
    结果  46-50
    讨论  50-53
  第三部分 RAI 16 基因真核表达质粒pEGFP-C1-RAI 16的构建及其生物学功能和作用机理的初步研究  53-73
    材料与方法  53-64
    结果  64-71
    讨论  71-73
  第四部分 Adenovirus-RAI 16 重组腺病毒的构建和RAI 16 生物学功能及作用机理的初步研究  73-111
    材料与方法  73-93
    结果  93-107
    讨论  107-111
  全文总结  111-112
  致谢  112-113
  参考文献  113-123
文献综述肝癌诱导分化机制的研究进展  123-137
  参考文献  131-137
硕士期间撰写发表的文章  137

Tec激酶区作用蛋白RAI 16的功能和分化调控机理初步研究

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