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人类心脏发育候选基因ZNF382和CXXC5的功能研究

作　者: 廖鹏
导　师: 吴秀山；朱传炳
学　校: 湖南师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 心脏发育 ZNF382 MYL2 酵母双杂交免疫共沉淀 CXXC5 细胞凋亡 TNF-a caspse-8 caspase-3
分类号: Q987
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

人类心脏发育是一个错综复杂的过程,受一系列转录因子调控。目前虽然已经鉴定出很多心脏发育转录调控因子,但仍有很多心脏发育调控基因有待鉴定,其分子调控机制有待深入研究。ZNF382是我室克隆鉴定的一个人类心脏发育候选基因(登陆号NM 032825),该基因在不同时期人类胚胎组织中广泛表达,在成人组织其表达限制在心脏,其表达特征提示ZNF382可能在心脏和肌肉发育和功能中起着潜在的调控作用。本文作者继续研究ZNF382在心脏和肌肉发育中的功能。RT-PCR实验结果表明,在C2C12细胞中诱导肌细胞分化后,其内源MHC和ZNF382的mRNA水平随诱导时间的延长而上调。报告基因转录活性分析表明,ZNF382单独不能激活MCK(MCK4800-luc)的转录活性,但能够与MyoD和E12共同激活MCK的转录活性,表明ZNF382是与MyoD和E12协同调控肌细胞的分化过程。为了鉴定ZNF382的相互作用蛋白,我们利用酵母双杂交技术,从成人心脏文库中筛选并鉴定出1个与ZNF382发生相互作用的蛋白MYL2。MYL2编码调控轻链相关心脏肌球蛋白β,提示ZNF382与MYL2可能共同参与心脏发育和功能的调控过程。我们首先利用亚细胞的定位实验研究ZNF382和MYL2在HEK293细胞中的定位情况。研究结果表明ZNF382定位于细胞核,MYL2在细胞核质中均有表达,当两者共同转入细胞时,MYL2蛋白大部分转移到了细胞核中,出现趋核现象,表明这两个蛋白在细胞内发生相互作用。为了进一步证明ZNF382和MYL2是否发生相互作用,我们通过免疫共沉淀实验进行验证。发现MYC标记的MYL2能被FLAG标记的ZNF382沉淀,而FLAG标记的ZNF382同样可以被MYC标记的MYL2沉淀,结果表明两者在体内确实存在相互作用。前人研究结果表明,MYL2是通过钙离子触发调节轻链的磷酸化,磷酸化后的MYL2反过来又触发肌肉的收缩状态。MYL2碱基突变能导致中左心室腔心室肥厚型心肌病。ZNF382和MYL2是否共同在左心室腔心室肥厚型心肌病发生中起调控作用,将是后续研究工作的一个重点。另外,我们还克隆了一个新的人类zf-CXXC结构的锌指基因CXXC5,该基因编码322个氨基酸,在物种进化上高度保守。RT-PCR分析表明CXXC5在成人及胎儿的组织中广泛表达。CXXC5定位于细胞核和细胞质中。在细胞过表达CXXC5使导致细胞核浓缩,提示该基因可能与细胞凋亡的发生有关。利用HEK293细胞系,我们首先通过流式细胞仪进一步检测CXXC5是否能促使细胞凋亡。结果表明,过表达CXXC5使细胞大量地停滞在G1前期。然后通过TUNEL法检测过表达CXXC5是否能使细胞出现细胞凋亡的表型,结果表明,瞬时过表达CXXC5的大部分细胞出现细胞凋亡的阳性结果,表明CXXC5确实与细胞凋亡的发生有关。为了研究CXXC5导致细胞凋亡的发生机制,我们利用报告基因系统和western blot研究CXXC5参与细胞凋亡的信号通路。根据细胞凋亡关键因子caspase的作用方式,细胞凋亡可分为受体途径和线粒体途径。WNF-a途径是受体途径的一种主要途径,又可分为死亡途径和促生存途径(JNK和NF-KB)。研究结果表明,过度表达CXXC5抑制p53的转录活性,但激活TNF-a转录的活性。在TNF-a下游途径中,过度表达CXXC5抑制c-jun,AP-1和NF-KB的转录活性,但激活caspase-8和caspase-3转录的活性,表明CXXC5是通过激活TNF-a的caspase途径调控细胞凋亡。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-12
第一部分人类心脏发育候选基因ZNF382  12-43
  第一章心脏发育及其相关基因  12-28
    1.1 心脏发育过程  12-13
    1.2 调控果蝇心脏发育的基因  13-15
      1.2.1 tin基因的功能及表达  13-14
      1.2.2 wg及其相关的基因  14-15
    1.3 调控脊椎动物心脏发育的基因  15-17
      1.3.1 同源盒基因(homeoboxgenes)  15-16
      1.3.2 Hand1和Hand2基因  16
      1.3.3 GATA基因  16-17
      1.3.4 MEF-2基因  17
    1.4 MYL2基因家族  17-18
    1.5 骨骼肌发育  18-23
      1.5.1 MyoD家族生肌调节因子  18-19
      1.5.2 肌肉增强子结合因子和生肌调节因子  19-20
      1.5.3 生肌调节因子与其它因子的相互作用  20-21
      1.5.4 生肌调节因子和肌肉增强子在成肌不同阶段的作用  21-22
      1.5.5 成肌细胞的最后分化  22-23
      1.5.6 小结  23
    1.6 Zinc Finger基因家族  23-24
    1.7 酵母双杂交技术  24-28
  第二章心脏发育候选基因ZNF382的功能研究  28-41
    2.1 材料和方法  28-34
      2.1.1 PCR获得ZNF382 cDNA全长  28-29
      2.1.2 载体构建  29
      2.1.3 酵母双杂交  29-31
      2.1.4 细胞的培养和转化  31
      2.1.5 SDS-PAGE  31-32
      2.1.6 免疫印迹  32
      2.1.7 免疫共沉淀  32-33
      2.1.8 荧光报告基因分析  33-34
      2.1.9 亚细胞定位  34
    2.2 实验结果  34-41
      2.2.1 酵母双杂交筛选ZNF382相互作用蛋白  34-35
      2.2.2 MYL2的功能  35-36
      2.2.3 ZNF382蛋白与MYL2蛋白的相互作用研究  36-38
      2.2.4 ZNF382的初步功能研究  38-39
      2.2.5 荧光素酶报告基因分析  39-41
  第三章总结  41-42
  第四章讨论  42-43
第二部分人类基因CXXC5的功能研究  43-61
  第一章前言  43-45
  第二章材料与方法  45-49
    2.1 获得CXXC5全长及生物信息学分析  45
    2.2 RNA提取和RT-PCR  45-46
    2.3 质粒的构建  46
    2.4 RNAi的分析  46-47
    2.5 TUNEL法检测细胞凋亡  47
    2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡  47-48
    2.7 caspase-8和caspase-3酶活性测定  48
    2.8 Western blot分析  48-49
  第三章结果  49-60
    3.1 分子特性和进化保护人类CXXC5  49-50
    3.2 CXXC5表达分布  50-51
    3.3 CXXC5蛋白的亚细胞定位  51-52
    3.4 CXXC5诱导细胞凋亡  52-54
    3.5 CXXC5激活TNF-a转录的活性  54-59
    3.7 CXXC5激活caspase-8和caspase-3的蛋白  59-60
  第四章讨论  60-61
参考文献  61-68
附录:中英文缩写词简表  68-70
致谢  70-71

人类心脏发育候选基因ZNF382和CXXC5的功能研究

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