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大豆疫霉RXLR效应分子靶标的筛选

作　者: 黄茜
导　师: 王源超
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆疫霉 RXLR效应分子 过敏性反应 酵母双杂交
分类号: S435.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


由大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaufinann & Gerdemann)侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。寄主的抗病性是控制大豆疫病最有效的措施,但是在大豆疫霉侵染寄主过程中,病原菌能分泌大量的效应分子破坏植物的抗病反应。大豆疫霉基因组编码大约350个左右含有RXLR motif的效应蛋白,已有研究证明这些效应蛋白进入寄主细胞后具有阻断植物抗病反应,提高病原菌侵染的能力。但是,关于这些效应分子进入植物细胞后和哪些植物靶标相互作用,如何干扰植物的防卫反应还缺乏研究。目前已经鉴定了包括AvrB、AvrRpm1和AvrRpt2等植物病原细菌效应分子的作用靶标,由于植物抗病反应信号通路的高度保守性,我们推测疫霉菌可能利用同样的途径干扰植物的防卫反应,因此我们克隆了多个植物病原细菌效应分子的的靶标基因,如AtRin4, AtHSP90, AtSGT1b, AtRAR1, StR3a。通过酵母双杂交检测,我们发现AtSGT1b可以与PsAvr1b-sp互作。通过生物信息学分析我们在大豆疫霉的寄主植物大豆和本氏烟中寻找到了与AtSGT1b具有较高同源性的5个相似序列GmSGT01 (Glyma01g43150.1). GmSGT02 (Glyma16g29450.1)、GmSGT03 (Glyma09g23980.1)、GmSGT04 (Glymal0g37440.1)和NbSGTl.1。随后,我们成功克隆了以上5个基因,并再次通过酵母双杂交技术证明GmSGT01、GmSGT03可能与PsAvr1b-sp特异互作。作为植物抗病信号通路的重要组成部分,MAPK信号通路成为各类效应分子的攻击目标。本文利用马铃薯病毒载体PVX系统,在烟草细胞内高效表达MAPK信号通路上的一个关键激酶NbMKK1 (Nicotiana Benthamiana),可以引起本氏烟的HR反应,而共表达一些效应分子PsAvh331-sp、PsAvh94-sp和PsAvh328-sp可以抑制由其诱导的HR反应。根据这个结果,我们利用酵母双杂交实验证明PsAvh94-sp和NbMKK1可能是直接互作的。我们以此推断大豆疫霉效应分子PsAvh94可以阻断植物免疫信号传递通路。

全文目录


摘要  7-8ABSTRACT  8-9引言  9-11上篇 文献综述  11-39  第一章 细菌和真菌的效应分子研究进展  12-39    1 植物免疫系统  12-18      1.1 Ⅲ型分泌系统  12-13      1.2 效应分子  13      1.3 植物免疫系统的两道防线  13-14      1.4 植物先天免疫  14-15      1.5 基础抗性  15      1.6 PTI  15-16      1.7 成功的病原物可以抑制PTI  16-17      1.8 ETI  17      1.9 总结与展望  17-18    2 细菌效应分子的靶标  18-26      2.1 BAK1  19      2.2 AtRin4  19-21      2.3 AtRAR1  21      2.4 PiAvrPto和Pto  21-23      2.5 AtMin7  23      2.6 HopAI1  23-24      2.7 SGT1  24-25      2.8 总结与展望  25-26    3 真菌和卵菌效应分子靶标的研究进展  26-29      3.1 致病疫霉  26-27      3.2 番茄叶霉菌  27-28      3.3 Toll样受体  28      3.4 总结与展望  28-29    4 总结  29    参考文献  29-39下篇 研究内容  39-79  第一章 大豆疫霉RXLR效应分子结合蛋白的筛选  40-64    1 材料与方法  41-50      1.1 试剂及培养基  41-42      1.2 疫霉效应分子基因的确定及扩增  42-43      1.3 候选靶标基因的确定及扩增  43      1.4 酵母菌株与培养条件  43-44      1.5 酵母双杂交载体的构建  44      1.6 Bait、Prey蛋白毒性与自激活活性的检测  44-45      1.7 Western blot验证目的蛋白的表达  45-48      1.8 酵母双杂交  48      1.9 转化子验证及报告基因的检测  48-50      1.10 PsAvr1b-1和SGT基因表达分析方法  50    2 结果与分析  50-58      2.1 候选互作基因的克隆和双杂交载体的构建  50-51      2.2 Bait、Prey蛋白无毒性无自激活活性  51-52      2.3 Western blot验证目的蛋白的表达  52      2.4 AtSGT1b可能与PsAvr1b-sp直接互作  52-54      2.5 GmSGT和NbSGT基因的克隆及序列分析  54-56      2.6 PsAvr1b-1和SGT1的转录分析  56-57      2.7 GmSGT01、GmSGT03与PsAvr1b-sp互作的验证  57-58    3 讨论  58-59    参考文献  59-64  第二章 鉴定与本氏烟NBMKKl互作的蛋白  64-79    1 材料与方法  65-70      1.1 供试菌株和烟草及培养条件  65      1.2 大豆疫霉菌丝基因组DNA的提取和烟草叶片cDNA的合成  65-66      1.3 候选互作基因克隆  66      1.4 NbMKK1过量表达对烟草细胞的影响  66-68      1.5 大豆疫霉效应分子抑制NbMKK1引起的烟草细胞死亡的分析方法  68      1.6 酵母菌株与培养条件  68      1.7 酵母双杂交载体的构建  68-69      1.8 Bait、Prey蛋白毒性与自激活活性的检测  69      1.9 Western blot验证目的蛋白的表达  69      1.10 酵母双杂交  69      1.11 转化子验证及报告基因的检测  69-70    2 结果与分析  70-75      2.1 候选互作基因的克隆和双杂交载体的构建  70      2.2 NbMKK1过量表达引起烟草细胞死亡  70-71      2.3 RXLR类效应分子抑制NbMKK1诱导的HR反应  71-73      2.4 Bait、Prey蛋白无毒性无自激活活性  73      2.5 Western blot验证目的蛋白的表达  73      2.6 PsAvh94-sp可能与NbMKK1直接互作  73-75    3 讨论  75-76    参考文献  76-79附录  79-82攻读硕士学位期间发表的研究论文  82-84致谢  84

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 油料作物病虫害 > 大豆病虫害
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