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大豆半胱氨酸蛋白酶基因GmCASc的克隆及初步功能分析
作 者: 郭秋辉
导 师: 杨守萍
学 校: 南京农业大学
专 业: 作物遗传育种
关键词: 大豆 质核互作雄性不育 半胱氨酸蛋白酶 基因克隆 酵母双杂交
分类号: S565.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
质核互作雄性不育在作物杂种优势利用中起重要作用,研究其遗传基础和机制具有重要的理论和实践意义。本研究在大豆质核互作雄性不育系和保持系的差异蛋白质组学研究基础上,进一步对差异表达蛋白半胱氨酸蛋白酶进行基因克隆并对其功能进行初步分析,获得如下结果:1.根据半胱氨酸蛋白酶的质谱数据,在大豆基因组数据库中搜索,发现一个相似性很高的基因,采用PCR技术扩增得到其全长cDNA,命名为GmCASc,该基因包含一个1101bp的阅读框,编码366个氨基酸,推导的GmCASc分子量为40.8kD、等电点为7.49;同源性分析表明GmCASc与毛果杨(Populus trichocarpa,XP 002323761)、葡萄(Vitis vinifera, XP002264984)、蓖麻(Ricinus communis、XP 002525857)和水稻(Oryza saliva Japonica Group, EAZ27173)的CASPASE同源性分别是54%、52%、56%和44%;生物信息学分析表明,GmCASc具有CASPASE结构域,属于胱天蛋白酶亚家族,该蛋白是一个非跨膜的亲水蛋白。2、利用实时荧光定量PCR方法检测大豆不同组织器官和不同胁迫条件下GmCASc的表达情况,结果显示GmCASc在质核互作雄性不育系NJCMS1A、NJCMS2A和其相应保持系NJCMS1B、NJCMS2B的根、茎、叶、花中都有表达,以茎中基因的相对表达量最高;不育系NJCMS1A花中GmCASc的相对表达量低于保持系NJCMS1B,而不育系NJCMS2A花中GmCASc的相对表达量高于保持系NJCMS2B; GmCASc在叶片中响应生物和非生物胁迫的应答各不相同,低温胁迫下,GmCASc表达下调,盐胁迫、SMV及机械损伤均引起GmCASc mRNA的累积。3、应用酵母双杂交系统研究大豆半胱氨酸蛋白酶、V型H+-ATP酶亚基、腺苷酸脱氨酶、寡尿苷酸结合酶、Cullin、β-香树素合成酶、MADS-box蛋白、淀粉分枝酶间的相互作用,结果发现只有转化pGBKT-7-GmCASc与pGADT-7-MADS-box的酵母阳性克隆能够在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His平板上生长并显示β-gal活性,表明GmCASc与MADS-box之间存在相互作用,推测GmCASc与MADS-box可能在细胞凋亡信号转导通路中协同相互作用,从而引起大豆质核互作雄性不育。
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全文目录
摘要 6-7ABSTRACT 7-9第一部分 9-23 文献综述 10-23 1. 植物雄性不育 10-14 1.1 植物雄性不育概述 10-11 1.2 植物雄性不育的分类 11-12 1.3 大豆质核互作雄性不育 12-14 2 植物半胱氨酸蛋白酶 14-18 2.1 植物半胱氨酸蛋白酶的分类 14-16 2.2 植物半胱氨酸蛋白酶的功能 16-18 3 植物表达基因分析方法 18-19 4 植物蛋白互作研究方法 19-23 4.1 酵母双杂交系统的原理 19-20 4.2 酵母双杂交系统特点 20-21 4.3 酵母双杂交系统的改进和发展 21-23第二部分 23-52 第一章 大豆半胱氨酸蛋白酶基因GmCASc的克隆、生物信息学与荧光定量分析 24-38 1 材料与方法 24-28 1.1 供试植物及其生长条件 24-25 1.2 总RNA的提取和第一链cDNA合成 25-26 1.3 基因克隆 26-27 1.3.1 PCR扩增 26 1.3.2 检测和回收 26-27 1.3.3 连接、转化 27 1.3.4 测序 27 1.4 荧光定量 27-28 2 结果与分析 28-36 2.1 GmCASc的cDNA克隆及生物信息学分析 28-34 2.2 GmCASc的表达分析 34-36 3 讨论 36-38 第二章 大豆质核互作雄性不育系与保持系间差异表达蛋白的互作研究 38-52 1 材料与方法 38-45 1.1 植物材料 38 1.2 菌株与质粒 38-39 1.3 试剂 39-41 1.5 基因片段的获得 41-42 1.6 载体片段、基因片段的获得 42-43 1.7 基因片段和载体片段的连接 43 1.8 连接产物的转化 43 1.9 连接产物的验证 43 1.10 酵母转化 43-44 1.11 β—gal分析 44-45 1.12 酵母菌落PCR 45 2 结果与分析 45-48 2.1 基因片段的扩增结果 45 2.2 酵母双杂载体的构建 45-47 2.3 差异表达蛋白间的相互作用测定 47-48 3 讨论 48-52全文结论 52-54参考文献 54-62致谢 62
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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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