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血管生成素与Fibulin蛋白家族相互作用的验证与功能探索
作 者: 汤佳城
导 师: 许正平
学 校: 浙江大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 血管生成素 血管生成 Fibulin蛋白家族 Fibulin-5 蛋白质相互作用 酵母双杂交 蛋白沉降技术 免疫共沉淀
分类号: R735.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
血管生成素 的学位论文">血管生成素(Angiogenin, ANG)是最初从人结肠癌细胞系HT-29培养液中分离纯化得到的生长因子,因其具有强烈的促血管生成活性而得名。它是一个单链碱性蛋白质,由123个氨基酸残基组成,分子量约为14 kDa。目前,已经知道血管生成素作为一个重要的血管生成因子,在肿瘤血管生成的过程中发挥重要作用,它可激活细胞外周的蛋白酶并降解基底膜和胞外基质、可活化信号通路、可进入靶细胞的细胞核并促进rRNA转录,从而促进血管内皮细胞及平滑肌细胞的迁移、增殖和粘附。但从总体上看,对血管生成素促进血管生成的分子机制认识还不全面,许多方面尚待深入研究。蛋白质是生命活动的体现者和执行者,蛋白质-蛋白质之间的相互作用几乎参与了每一个生物学过程,并在其中扮演极其重要的角色。在我们的前期工作中,已经利用酵母双杂交的方法从人肝脏cDNA文库和心肌cDNA文库中筛选到了一些可能与血管生成素有相互作用的蛋白质,其中包括Fibulin-1、Fibulin-2、含表皮生长因子结构域的Fibulin样胞外基质蛋白1 (EGF-containing Fibulin-like Extracellular Matrix Protein 1, EFEMP1,又称Fibulin-3)、含表皮生长因子结构域的Fibulin样胞外基质蛋白2(EGF-containing Fibulin-like Extracellular Matrix Protein 2, EFEMP2,又称Fibulin-4)四个蛋白。因此,在本论文中我们利用蛋白沉降实验(GST pull down)技术验证了Fibulin-1、-2、-3、-4与血管生成素相互作用的真实性。分析发现,Fibulin家族另一成员Fibulin-5和Fibulin-1,-2,-3,-4在氨基酸序列上存在着很高的相似性,它们多数的结构域也相同。据此,我们推测Fibulin-5也极有可能与ANG存在着相互作用,并通过酵母双杂交实验、GST蛋白沉降(GST-pull down)实验和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)实验得到了证实。这一发现扩充了实验室前期发现的血管生成素相互作用蛋白数据库,为探索血管生成素作用机制提供了新的线索。Fibulin-5是一个胞外基质糖蛋白,广泛分布于富含弹性蛋白的组织中,可通过与其它胞外蛋白相互作用而调节基质的结构。近来研究发现Fibulin-5是一个内源性血管生成抑制剂,可支持细胞粘附,并可抑制FN介导的细胞迁移。鉴于Fibulin-5与ANG间存在相互作用并且都参与血管生成过程的调节,我们首先检测了ANG与Fibulin-5在胞外的相互作用对HUVE细胞粘附的可能影响。实验结果显示,将二者混合的蛋白基质未能明显改变Fibulin-5对HUVE细胞的粘附过程。此外,我们利用Transwell模型检测了ANG与Fibulin-5相互作用对内皮细胞迁移的可能影响,发现Fibulin-5可明显抑制HUVE细胞对FN蛋白的迁移,但在加入ANG蛋白后Fibulin-5的这一抑制效应并未明显改变,说明在该实验条件下,Fibulin-5与ANG的相互作用不参与Fibulin-5抑制HUVE细胞对FN蛋白的迁移过程。综上所述,本学位论文首次证实血管生成素与Fibulin家族Fibulin-1、-2、-3、-4、-5成员存在相互作用,并分析得到了它们与血管生成素相互作用可能的保守模序,命名为FBLN-ANG模序,该模序未在其它胞外蛋白中找到。此外,利用体外模型对Fibulin-5与血管生成素相互作用在血管生成过程中的生物学意义进行了探索,发现二者相互作用未改变Fibulin-5对内皮细胞迁移和粘附的功能。下一步工作的重点应放在两个方面:第一,对含有FBLN-ANG模序的Fibulin蛋白采用突变的方法明确该模序在Fibulin蛋白家族与ANG相互作用过程中的重要性,进而找到Fibulin蛋白家族与血管生成素相互作用的具体位点;第二,进一步探索Fibulin蛋白家族成员与ANG相互作用的生物学意义。
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全文目录
致谢 4-5 摘要 5-7 Abstract 7-9 缩略语 9-12 1. 引言 12-15 2. 原理和技术路线 15-20 2.1 酵母双杂交技术 15-16 2.2 GST融合蛋白下拉技术 16-17 2.3 免疫共沉淀技术 17-18 2.4 Transwell实验技术 18-19 2.5 荧光实时定量PCR技术 19-20 3. 主要仪器设备、材料与试剂 20-30 3.1 主要仪器设备 20-21 3.2 主要耗材 21 3.3 细胞、细菌及其培养液 21-22 3.4 主要试剂 22-23 3.5 缓冲液和溶液等的配制 23-30 4. 实验方法 30-46 4.1 质粒的构建 30-32 4.2 生物信息学工具分析蛋白序列 32-34 4.3 酵母双杂交技术 34-36 4.4 GST融合蛋白下拉技术 36-38 4.5 免疫共沉淀技术 38-39 4.6 GST蛋白纯化实验 39 4.7 内皮细胞粘附实验 39-40 4.8 内皮细胞迁移实验 40-41 4.9 实时荧光定量PCR实验 41-46 5. 实验结果 46-56 5.1 构建质粒的酶切鉴定 46 5.2 生物信息学工具分析Fibulin蛋白家族的蛋白序列 46-47 5.3 使用酵母双杂交技术验证ANG与Fibulin蛋白家族的相互作用 47-49 5.4 使用GST融合蛋白下拉技术验证ANG与Fibulin蛋白家族的相互作用 49-51 5.5 使用免疫共沉淀技术验证ANG与FBLN-5的相互作用 51 5.6 原核表达与纯化GS-FBLN-5融合蛋白 51-52 5.7 检测ANG与FBLN-5相互作用对内皮细胞粘附的可能影响 52-54 5.8 使用Transwell检测ANG与FBLN-5相互作用对内皮细胞迁移的可能影响 54-55 5.9 验证ANG对FBLN-3在Hela细胞中表达的调控 55-56 6. 讨论 56-59 6.1 ANG与Fibulin蛋白家族相互作用的验证 56-57 6.2 ANG与FBLN-5相互作用的功能探索 57-59 7. 结论 59-60 参考文献 60-63 综述 63-75 参考文献 72-75 作者简介及在读期间所取得的科研成果 75-76 补充材料 76-77
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤
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