血管生成素(Angiogenin, ANG)是最初从人结肠癌细胞系HT-29培养液中分离纯化得到的生长因子,因其具有强烈的促血管生成活性而得名。它是一个单链碱性蛋白质,由123个氨基酸残基组成,分子量约为14 kDa。目前,已经知道血管生成素作为一个重要的血管生成" />

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血管生成素与Fibulin蛋白家族相互作用的验证与功能探索

作　者: 汤佳城
导　师: 许正平
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 血管生成素血管生成 Fibulin蛋白家族 Fibulin-5 蛋白质相互作用酵母双杂交蛋白沉降技术免疫共沉淀
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

血管生成素的学位论文">血管生成素(Angiogenin, ANG)是最初从人结肠癌细胞系HT-29培养液中分离纯化得到的生长因子,因其具有强烈的促血管生成活性而得名。它是一个单链碱性蛋白质,由123个氨基酸残基组成,分子量约为14 kDa。目前,已经知道血管生成素作为一个重要的血管生成因子,在肿瘤血管生成的过程中发挥重要作用,它可激活细胞外周的蛋白酶并降解基底膜和胞外基质、可活化信号通路、可进入靶细胞的细胞核并促进rRNA转录,从而促进血管内皮细胞及平滑肌细胞的迁移、增殖和粘附。但从总体上看,对血管生成素促进血管生成的分子机制认识还不全面,许多方面尚待深入研究。蛋白质是生命活动的体现者和执行者,蛋白质-蛋白质之间的相互作用几乎参与了每一个生物学过程,并在其中扮演极其重要的角色。在我们的前期工作中,已经利用酵母双杂交的方法从人肝脏cDNA文库和心肌cDNA文库中筛选到了一些可能与血管生成素有相互作用的蛋白质,其中包括Fibulin-1、Fibulin-2、含表皮生长因子结构域的Fibulin样胞外基质蛋白1 (EGF-containing Fibulin-like Extracellular Matrix Protein 1, EFEMP1,又称Fibulin-3)、含表皮生长因子结构域的Fibulin样胞外基质蛋白2(EGF-containing Fibulin-like Extracellular Matrix Protein 2, EFEMP2,又称Fibulin-4)四个蛋白。因此,在本论文中我们利用蛋白沉降实验(GST pull down)技术验证了Fibulin-1、-2、-3、-4与血管生成素相互作用的真实性。分析发现,Fibulin家族另一成员Fibulin-5和Fibulin-1,-2,-3,-4在氨基酸序列上存在着很高的相似性,它们多数的结构域也相同。据此,我们推测Fibulin-5也极有可能与ANG存在着相互作用,并通过酵母双杂交实验、GST蛋白沉降(GST-pull down)实验和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)实验得到了证实。这一发现扩充了实验室前期发现的血管生成素相互作用蛋白数据库,为探索血管生成素作用机制提供了新的线索。Fibulin-5是一个胞外基质糖蛋白,广泛分布于富含弹性蛋白的组织中,可通过与其它胞外蛋白相互作用而调节基质的结构。近来研究发现Fibulin-5是一个内源性血管生成抑制剂,可支持细胞粘附,并可抑制FN介导的细胞迁移。鉴于Fibulin-5与ANG间存在相互作用并且都参与血管生成过程的调节,我们首先检测了ANG与Fibulin-5在胞外的相互作用对HUVE细胞粘附的可能影响。实验结果显示,将二者混合的蛋白基质未能明显改变Fibulin-5对HUVE细胞的粘附过程。此外,我们利用Transwell模型检测了ANG与Fibulin-5相互作用对内皮细胞迁移的可能影响,发现Fibulin-5可明显抑制HUVE细胞对FN蛋白的迁移,但在加入ANG蛋白后Fibulin-5的这一抑制效应并未明显改变,说明在该实验条件下,Fibulin-5与ANG的相互作用不参与Fibulin-5抑制HUVE细胞对FN蛋白的迁移过程。综上所述,本学位论文首次证实血管生成素与Fibulin家族Fibulin-1、-2、-3、-4、-5成员存在相互作用,并分析得到了它们与血管生成素相互作用可能的保守模序,命名为FBLN-ANG模序,该模序未在其它胞外蛋白中找到。此外,利用体外模型对Fibulin-5与血管生成素相互作用在血管生成过程中的生物学意义进行了探索,发现二者相互作用未改变Fibulin-5对内皮细胞迁移和粘附的功能。下一步工作的重点应放在两个方面：第一,对含有FBLN-ANG模序的Fibulin蛋白采用突变的方法明确该模序在Fibulin蛋白家族与ANG相互作用过程中的重要性,进而找到Fibulin蛋白家族与血管生成素相互作用的具体位点；第二,进一步探索Fibulin蛋白家族成员与ANG相互作用的生物学意义。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-9
缩略语  9-12
1. 引言  12-15
2. 原理和技术路线  15-20
  2.1 酵母双杂交技术  15-16
  2.2 GST融合蛋白下拉技术  16-17
  2.3 免疫共沉淀技术  17-18
  2.4 Transwell实验技术  18-19
  2.5 荧光实时定量PCR技术  19-20
3. 主要仪器设备、材料与试剂  20-30
  3.1 主要仪器设备  20-21
  3.2 主要耗材  21
  3.3 细胞、细菌及其培养液  21-22
  3.4 主要试剂  22-23
  3.5 缓冲液和溶液等的配制  23-30
4. 实验方法  30-46
  4.1 质粒的构建  30-32
  4.2 生物信息学工具分析蛋白序列  32-34
  4.3 酵母双杂交技术  34-36
  4.4 GST融合蛋白下拉技术  36-38
  4.5 免疫共沉淀技术  38-39
  4.6 GST蛋白纯化实验  39
  4.7 内皮细胞粘附实验  39-40
  4.8 内皮细胞迁移实验  40-41
  4.9 实时荧光定量PCR实验  41-46
5. 实验结果  46-56
  5.1 构建质粒的酶切鉴定  46
  5.2 生物信息学工具分析Fibulin蛋白家族的蛋白序列  46-47
  5.3 使用酵母双杂交技术验证ANG与Fibulin蛋白家族的相互作用  47-49
  5.4 使用GST融合蛋白下拉技术验证ANG与Fibulin蛋白家族的相互作用  49-51
  5.5 使用免疫共沉淀技术验证ANG与FBLN-5的相互作用  51
  5.6 原核表达与纯化GS-FBLN-5融合蛋白  51-52
  5.7 检测ANG与FBLN-5相互作用对内皮细胞粘附的可能影响  52-54
  5.8 使用Transwell检测ANG与FBLN-5相互作用对内皮细胞迁移的可能影响  54-55
  5.9 验证ANG对FBLN-3在Hela细胞中表达的调控  55-56
6. 讨论  56-59
  6.1 ANG与Fibulin蛋白家族相互作用的验证  56-57
  6.2 ANG与FBLN-5相互作用的功能探索  57-59
7. 结论  59-60
参考文献  60-63
综述  63-75
  参考文献  72-75
作者简介及在读期间所取得的科研成果  75-76
补充材料  76-77

血管生成素与Fibulin蛋白家族相互作用的验证与功能探索

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