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马链球菌兽疫亚种类M蛋白与猪血管内皮细胞互作蛋白筛选

作　者: 张言召
导　师: 范红结
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 马链球菌兽疫亚种 类M蛋白 猪血管内皮细胞 酵母双杂交系统 蛋白互作
分类号: S852.611
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus)对集约化养猪业的发展危害严重,是我国猪链球菌病的主要病原。类M蛋白是该菌的一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,且能够抵抗吞噬细胞对其的吞噬作用。本试验通过酵母双杂交系统筛选猪脐静脉血管内皮细胞中与类M蛋白的相互作用的蛋白质,为进一步阐明该菌的致病机制进行了探索。以猪脐静脉血管内皮细胞(SUVECs)为研究对象,提取总RNA,经分离获得mRNA,采用SMART技术合成cDNA第一链,并通过LD-PCR合成双链cDNA。用限制性内切酶SfiI酶切后连接到pGADT7 AD载体质粒上,利用电转化法将重组质粒转化大肠杆菌DH10B中构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明：初始文库库容量为1.01×107CFUs,重组率接近100%,插入片段在1.8-4.4kb之间,平均插入片段为2.7kb,达到了用于目的基因的分离筛选及克隆表达的建库要求。根据已发表的马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的类M蛋白基因序列,设计和合成一对引物,并以ATCC35246株的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增出去掉信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至酵母表达载体pGBKT7中,构建诱饵质粒pGBKT7-szp。重组质粒通过酶切鉴定和测序后转化入酵母菌株Y2HGold中进行表达,融合蛋白经自激活、毒性及Western blot检测,结果显示,构建的诱饵蛋白满足酵母双杂交系统的要求。使用酵母双杂交系统,筛选SUVECs全长cDNA文库中与类M蛋白相互作用的蛋白质的编码序列：通过诱饵酵母菌株Y2HGold[pGBKT7-szp]与SUVECs cDNA文库酵母菌株Y187[pGADT7-cDNA]交配形成二倍体酵母,经含X-α-gal及Aureobasidin A的营养缺陷型培养基(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)筛选后获得蓝色克隆,提取质粒,转化入大肠杆菌DH5a扩增并提取文库质粒。获得的文库质粒再回复酵母酵母双杂交系统验证其表达的蛋白与类M蛋白间的相互作用关系。结果显示,未能从构建的SUVECs全长cDNA文库中筛选到与类M蛋白相互作用的蛋白质。

全文目录


摘要  7-8ABSTRACT  8-9第一篇 文献综述  9-29  第一章 马链球菌兽疫亚种毒力因子  9-21    1 类M蛋白  9-13    2 金属脂结合蛋白  13    3 链激酶  13-14    4 IgG结合蛋白  14-15    5 纤维结合素结合蛋白  15    6 透明质酸荚膜  15-17    参考文献  17-21  第二章 酵母双杂交系统概述  21-29    1 酵母双杂交系统的基本原理  21-23    2 酵母双杂交系统的研究与发展  23-24    3 酵母双杂交系统的优点和局限性  24-25      3.1 酵母双杂交系统的优点  24-25      3.2 酵母双杂交系统的局限性  25    4 Matchmaker~(TM) Gold Yeast Two-Hybrid System  25-27    参考文献  27-29第二篇 试验部分  29-71  第三章 猪脐静脉血管内皮细胞全长cDNA文库的构建  29-47    摘要  29-30    1 材料  30-31      1.1 细胞、血清及培养基  30      1.2 质粒及菌株  30-31      1.3 主要试剂  31      1.4 培养基及相关溶液的配置  31    2 方法  31-39      2.1 猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)的培养  31-32      2.2 SUVEC总RNA的提取及mRNA的分离  32      2.3 SUVEC cDNA的合成及扩增  32-33      2.4 SUVEC ds cDNA的酶切、分级分离及收集  33-35      2.5 载体质粒pGADT7 AD(改造)的酶切及纯化回收  35      2.6 ds cDNA与载体质粒pGADT7 AD的连接  35-36      2.7 重组pGADT7-cDNA电转化大肠杆菌DH10B及扩增文库  36      2.8 cDNA文库质量鉴定  36-37      2.9 文库克隆的收集及质粒的提取  37-38      2.10 文库质粒pGADT7-cDNA转化Y187酵母菌株  38-39    3 结果  39-43      3.1 总RNA的提取及分离的mRNA  39-40      3.2 ds cDNA的合成及鉴定  40-41      3.3 ds cDNA片段的酶切及分级分离  41      3.4 初始文库库容及文库的PCR鉴定  41-42      3.5 文库质粒的提取及琼脂糖凝胶电泳检测  42-43      3.6 Y187[pGADT7-cDNA]文库菌液分装  43    4 讨论  43-45    参考文献  45-46    ABSTRACT  46-47  第四章 诱饵蛋白的构建及有效性验证  47-59    摘要  47-48    1 材料  48      1.1 质粒与菌株  48      1.2 主要试剂  48      1.3 培养及相关溶液的配置  48    2 方法  48-53      2.1 ATCC35246菌株的培养及模板DNA的提取  48-49      2.2 诱饵质粒pGBKT7-szp的构建  49-51      2.3 诱饵质粒pGBKT7-szp有效性检测  51-53    3 结果  53-55      3.1 目的基因szp的PCR结果  53      3.2 重组质粒pGBKT7-szp的酶切鉴定  53-54      3.3 测序结果  54      3.4 诱饵质粒pGBKT7-szp自激活及毒性检测结果  54      3.5 Western blot检测  54-55    4 讨论  55-56    参考文献  56-57    ABSTRACT  57-59  第五章 类M蛋白互作蛋白的筛选  59-71    摘要  59    1 材料  59-60      1.1 菌株及质粒  59-60      1.2 主要试剂  60      1.3 培养基及相关溶液的配置  60    2 方法  60-65      2.1 对照实验  60-61      2.2 猪血管内皮细胞cDNA文库的筛选  61-63      2.3 阳性克隆中阴性文库质粒的剔除  63      2.4 阳性克隆中同种文库质粒的去重处理  63-64      2.5 阳性酵母克隆中文库质粒的提取及扩增  64      2.6 质粒的PCR鉴定  64      2.7 阳性相互作用蛋白的验证  64-65    3 结果  65-67      3.1 对照实验  65      3.2 SUVEC cDNA文库滴度测定  65      3.3 二倍体酵母菌的总克隆数及交配率(Mating Efficiency)  65-66      3.4 SUVEC cDNA文库筛选结果  66-67      3.5 阳性质粒的PCR鉴定  67      3.6 阳性相互作用蛋白的鉴定  67    4 讨论  67-69    参考文献  69-70    ABSTRACT  70-71附录  71-73致谢  73

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌 > 球菌
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