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酵母双杂交筛选猪血管内皮细胞中与猪瘟病毒NS2蛋白相互作用的蛋白

作　者: 康恺
导　师: 张彦明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒 NS2蛋白 酵母双杂交 猪血管内皮细胞
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪瘟(Classical swine fever, CSF)被世界动物卫生组织(OIE)列为必须上报的动物传染病之一。由于CSFV体外培养增殖滴度低且不引起细胞病变,所以国内外对CSFV的研究大多侧重于病毒的检测以及新型疫苗的研发,而对CSFV的致病机理研究相对较少。NS2蛋白为CSFV的一个非结构蛋白。现有资料表明,NS2蛋白通过与宿主细胞的相互作用对CSFV的复制有一定调节作用,并产生蛋白酶活性,切割NS2-3复合体释放NS3单体,而NS3单体的积聚会使接毒培养的细胞出现细胞病变(CPE)。但是目前对NS2蛋白与宿主细胞的相互作用以及调节病毒RNA复制的机制依然不很清楚。本文以研究NS2蛋白与宿主细胞蛋白相互作用为目标,采用酵母双杂交技术,对CSFV宿主细胞猪血管内皮细胞(SUVEC)中与NS2蛋白相互作用的蛋白进行了筛选。获得了以下研究结果:(1)从pGFP-NS2绿色荧光表达载体中扩增得到NS2基因C末端360 bp的编码区,并构建到pGBKT7-NS2-C360诱饵表达载体中,获得了对酵母细胞无毒性且没有自激活性的pGBKT7诱饵表达载体。(2)成功分离、纯化了猪血管内皮细胞双链cDNA,用来表达猎物文库的融合蛋白。(3)将pGBKT7-NS2-C360载体、双链cDNA、猎物载体pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞,经过筛选获得16个阳性克隆。经PCR、测序、比对分析获得8种与CSFV具有相互作用的已知蛋白,分别为胞质溶胶非特异2肽酶(CNDP2)、热休克蛋白40(Hsp40)、CFTR相关配体(CAL)、E3泛激素连接酶、ATP合成酶6 (ATPase6)、NRAS相关蛋白、细胞凋亡调节基因(MOAP1)和核糖核蛋白H1。本试验筛选得到8种已知蛋白,其中Hsp40蛋白的重复性比较高,且现有资料表明,Hsp40参与调节病毒RNA的复制。所以Hsp40将作为所筛选蛋白进一步研究的重点。

全文目录


摘要  6-7
ABSTRACT  7-11
文献综述  11-23
  第一章 猪瘟病毒NS2 蛋白研究进展  11-15
    1.1 NS2 蛋白与猪瘟病毒非致细胞病变型型向致细胞病变型转化  12-13
    1.2 猪瘟病毒NS2 蛋白酶作用以及切割NS2-3 复合体  13-14
    1.3 NS2 蛋白特性与宿主细胞相互作用研究  14-15
  第二章 酵母双杂交系统及发展应用  15-23
    2.1 酵母双杂交系统的理论甚础  15-16
    2.2 酵母双杂交系统的改进与发展  16-19
    2.3 酵母双杂交技术的应用  19-21
    2.4 酵母双杂交系统的优点与局限性  21
      2.4.1 酵母双杂交系统优点  21
      2.4.2 酵母双杂技系统缺点  21
    2.5 酵母双杂交技术前景展望  21-23
试验研究  23-46
  第三章 诱饵载体pGBKT7-NS2-C360 的构建及鉴定  23-31
    3.1 材料  23-25
      3.1.1 菌株和质粒  23
      3.1.2 试剂及试剂盒  23
      3.1.3 培养基及其配制  23-24
      3.1.4 主要仪器设备  24-25
    3.2 方法  25-27
      3.2.1 诱饵载体pGBKT7-NS2-C360 的构建  25-26
      3.2.2 重组质粒pGBKT7-NS2-C360 对酵母细胞毒性以及自激活性的检测  26-27
    3.3 结果  27-29
      3.3.1 PCR 扩增NS2-C360 目的基因  27-28
      3.3.2 诱饵质粒pGBKT7-NS2-C360 的酶切分析和PCR 鉴定  28
      3.3.3 酵母菌落PCR 鉴定  28-29
      3.3.4 诱饵蛋白自激活与毒性检测  29
    3.4 讨论  29-30
    3.5 小结  30-31
  第四章 猪血管内皮细胞双链cDNA 的制备  31-36
    4.1 材料  31
      4.1.1 细胞  31
      4.1.2 试剂与试剂盒  31
      4.1.3 仪器设备  31
    4.2 方法  31-33
      4.2.1 猪血管内皮细胞的复苏与培养  31
      4.2.2 细胞总RNA 的提取与纯度分析  31-32
      4.2.3 第一链cDNA 合成  32
      4.2.4 长距离PCR（LD-PCR）扩增dsDNA  32-33
      4.2.5 dsDNA 产物的纯化  33
    4.3 结果  33-34
      4.3.1 总RNA 的提取  33-34
      4.3.2 cDNA 的合成与纯化  34
    4.4 讨论  34-35
    4.5 小结  35-36
  第五章 酵母双杂交筛选与CSFV NS2 蛋白相互作用的蛋白  36-46
    5.1 材料  36-37
      5.1.1 菌株、质粒  36
      5.1.2 试剂及试剂盒  36
      5.1.3 培养基及配制  36-37
      5.1.4 仪器  37
    5.2 方法  37-40
      5.2.1 pGBKT7-NS2-C360，pGADT7-Rec，双链cDNA 共转化AH109  37-38
      5.2.2 对照菌株的转化  38-39
      5.2.3 阳性菌落的筛选与鉴定  39-40
      5.2.4 文库质粒的解救与测序  40
    5.3 结果  40-43
      5.3.1 共转化结果  40-41
      5.3.2 阳性克隆筛选结果  41
      5.3.3 阳性克隆的鉴定  41-42
      5.3.4 测序结果  42-43
    5.4 讨论  43-45
    5.5 小结  45-46
结论  46-47
参考文献  47-52
附录  52-55
缩略词  55-57
致谢  57-58
作者简介  58

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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