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植物病原卵菌RXLR效应蛋白Avr1b互作蛋白的初步筛选
作 者: 苑丽娜
导 师: 单卫星
学 校: 西北农林科技大学
专 业: 生化与分子生物学
关键词: 大豆疫霉菌 Avr1b RXLR效应蛋白 酵母双杂交
分类号: S432.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
卵菌(Oomycetes)包括疫霉菌、霜霉菌、腐霉菌等,大多都是重要的植物病原菌,在世界范围内,给许多农作物和花卉植物带来毁灭性危害。大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)是卵菌遗传学和病理学研究的重要模式种,引致重要农作物大豆的疫霉根腐病。研究植物与病原卵菌互作的分子机制,从分子水平上揭示植物的抗病机理,对卵菌类病害的有效防治具有重要的意义。在植物-病原互作过程中,病原菌的效应基因编码产物被植物识别时被称为无毒基因。病原卵菌编码一大类被称为RXLR的效应蛋白,在其信号肽序列下游含有保守的RxLR-dEER结构域。RXLR效应蛋白在卵菌致病过程中起关键的作用。大豆疫霉菌( P. sojae )的Avr1b基因在大豆疫霉菌与大豆互作中,除了被抗病基因Rpslb识别而激活植物抗病反应外,在不被识别的情况下还具有重要的毒性功能。本研究以实验室成功构建的寄生疫霉菌(P. parasitica)休止孢萌发阶段以及侵染拟南芥阶段的病组织cDNA文库为材料,利用酵母双杂交方法筛选鉴定与Avr1b互作的蛋白。采用PCR扩增获得Avr1b目的基因,克隆到酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7,构建诱饵载体pGBKT7-mAvr1b。通过cDNA文库(约2×10~7 cDNA克隆)筛选并经共转化反复验证确定了12个与Avr1b互作的候选蛋白。为了进一步研究Avr1b效应蛋白可能的植物靶标,经拟南芥同源序列比对,确定了同源程度较高的6个拟南芥基因序列。对其中4个候选植物靶标基因的进一步分析,获得与Avr1b效应蛋白互作的2个植物靶标蛋白。本项研究为进一步研究Avr1b效应蛋白的转运和在寄主植物细胞中的作用机理奠定了基础。
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全文目录
摘要 6-7 ABSTRACT 7-10 第一章 文献综述 10-19 1.1 卵菌的危害 10-11 1.1.1 植物病原卵菌与植物互作的研究 10-11 1.1.2 大豆疫霉菌的研究现状 11 1.2 病菌效应蛋白毒性靶标的研究进展 11-13 1.2.1 基因对基因假说 11-12 1.2.2 卵菌RXLR 效应蛋白研究概况 12 1.2.3 无毒基因Avr1b 12-13 1.2.4 效应蛋白毒性靶标 13 1.3 模式植物拟南芥研究概况 13-14 1.4 酵母双杂交研究进展 14-17 1.4.1 酵母双杂交系统的原理 14-15 1.4.2 酵母双杂交系统的优点及其局限性 15-17 1.4.3 酵母双杂交系统的用途及意义 17 1.5 本研究的理论基础 17-18 1.6 本研究的目的和意义 18-19 第二章 诱饵载体PGBKT7-Avr1b 的构建及鉴定 19-24 2.1 材料 19 2.1.1 菌株及载体 19 2.1.2 寄生疫霉菌休止孢萌发阶段以及侵染拟南芥阶段的病组织cDNA 文库 19 2.1.3 主要试剂及仪器 19 2.2 方法 19-23 2.2.1 实验所用引物 19-20 2.2.2 PCR 扩增目的片段mAvr1b 20-21 2.2.3 目的片段胶回收 21 2.2.4 目的片段及诱饵载体pGBKT7 酶切 21-22 2.2.5 转化大肠杆菌及酶切检测 22 2.2.6 重组质粒测序鉴定 22-23 2.3 结果与分析 23 2.3.1 诱饵载体构建结果 23 2.3.2 诱饵载体测序结果 23 2.4 讨论 23-24 第三章 效应蛋白Avr1b 的植物靶标的初步筛选 24-37 3.1 材料 24 3.2 方法 24-29 3.2.1 酵母感受态细胞的制备 24-25 3.2.2 诱饵蛋白的自激活检测 25-26 3.2.3 诱饵蛋白的毒性检测 26 3.2.4 cDNA 文库的筛选 26-27 3.2.5 酵母质粒提取 27 3.2.6 共转化验证 27-28 3.2.7 RT-PCR 扩增靶标基因 28-29 3.2.8 靶标载体的构建 29 3.2.9 共转化验证蛋白间相互作用 29 3.3 结果与分析 29-34 3.3.1 诱饵质粒自激活检测 29-30 3.3.2 诱饵蛋白毒性检测结果 30-31 3.3.3 Mating 方法筛选cDNA 文库结果 31 3.3.4 共转化方法回转验证 31-32 3.3.5 反复验证得到阳性候选靶标的序列分析结果 32-33 3.3.6 PCR 扩增靶标基因的结果 33 3.3.7 靶标载体的构建 33 3.3.8 诱饵蛋白与拟南芥植物靶标互作的共转化结果与分析 33-34 3.4 讨论 34-37 第四章 结论与创新点 37-38 4.1 结论 37 4.2 创新点 37-38 参考文献 38-43 附录 43-49 一、培养基配方 43-46 二、载体图谱 46-49 致谢 49-50 作者简介 50
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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵(传)染性病害
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