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Ta-siRNA途径调控百脉根根瘤发育的研究

作　者: 李晓琳
导　师: 孙杰；王彦章
学　校: 石河子大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 百脉根结瘤突变体结瘤自我调节 ta-siRNA
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

豆科植物能与土壤中的根瘤菌建立共生关系,在其根部形成固氮根瘤。共生固氮提供宿主植物生长所需要的氮,但产生过多的根瘤会影响植物的发育。因此,根瘤形成的数目受到宿主结瘤自我调节及环境因子的调控。本文对百脉根结瘤数减少的共生突变体rel3进行了表型鉴定和分子机理研究。在共生和非共生条件下,rel3的主根比野生型短,侧根数减少,结瘤数目约为野生型一半,结瘤区比率显著低于野生型。然而,突变体与野生型的固氮酶活力没有差异。这些表型分析表明rel3根瘤数目减少,可能是突变体结瘤区域变窄所致。用LacZ标记的根瘤菌接种突变体,发现rel3的侵染事件显著减少,这暗示rel3侵染频率的降低,使rel3的结瘤区域变窄,最终导致rel3的结瘤数目降低。为了进一步阐明REL3突变导致根瘤数目减少的分子机理,首先分析了rel3对结瘤负调控因子氮和乙烯的敏感性。结果表明,用硝酸盐和乙烯处理后,rel3和野生型产生相似的结瘤反应,这表明rel3中氮和乙烯对结瘤的调节不受影响。另外,通过野生型与突变体间的相互嫁接,结果显示rel3根瘤减少的表型主要受茎基因型控制。通过发根转化获得REL3启动子-GUS转化根系,分析表明REL3在根系的维管束组织特异表达,在根瘤器官起始处的维管组织中强烈表达,随着根瘤的发育,REL3继续在发育的维管束组织中表达。这表明REL3对于根瘤的起始起着重要的作用。REL3突变使植物体内TAS3 -siRNA的合成受阻,导致TAS3 -siRNA调控的靶基因即生长素应答因子ARF3和ARF4的表达上调。这些提示我们rel3结瘤减少可能与生长素有关。用生长素抑制剂NPA和TIBA处理后,rel3显示出更强的向地性丧失,表明rel3对生长素抑制剂的处理比野生型敏感,这暗示rel3根系中生长素的极性运输发生了改变。这种生长素极性运输的改变是否参与了根瘤起始的研究正在进行中。根据现有的研究结果,我们推测REL3的突变改变了根系中的生长素运输,使得根皮层细胞中的生长素浓度改变,导致根系中结瘤敏感区域根瘤起始所需要的生长素浓度范围变窄,因而产生较窄结瘤区域,从而形成较少的根瘤。本研究提供了ta-siRNA途径调控的生长素信号途径,直接参与了共生根瘤起始的证据。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
缩写词及专用名词  7-8
目录  8-10
前言  10-12
第一章豆科植物共生突变体的研究进展  12-29
  1.1 影响根毛发育的共生突变体  12-14
  1.2 不结瘤突变体  14-19
    1.2.1 结瘤因子受体相关突变体  15-17
    1.2.2 钙离子流动、根毛变形至钙震荡相关突变体  17
    1.2.3 钙震荡至根毛卷曲、侵染线和类瘤结构的形成相关突变体  17-18
    1.2.4 影响根毛卷曲,侵染线和类瘤结构形成过程之后的不结瘤突变体  18-19
  1.3 影响结瘤数目相关的突变体  19-21
    1.3.1 结瘤数增加的突变体  19-21
    1.3.2 结瘤数减少的突变体  21
  1.4 与激素信号有关的共生突变体  21-28
    1.4.1 生长素  22-23
    1.4.2 细胞分裂素  23-25
    1.4.3 乙烯  25-26
    1.4.4 脱落酸  26-28
  1.5 展望  28-29
第二章 Ta-siRNA途径调控百脉根根瘤发育的研究  29-59
  2.1 材料与方法  29-38
    2.1.1 植物材料  29-30
    2.1.2 菌株、质粒、抗生素、培养基及菌的培养  30-31
    2.1.3 酶及生化试剂  31
    2.1.4 DNA提取、质粒制备、转化以及DNA片段的纯化回收  31-34
    2.1.5 根瘤菌接种  34
    2.1.6 固氮酶活的测定  34-35
    2.1.7 发根农杆菌介导的百脉根发根根系转化  35
    2.1.8 拟南芥转化  35-36
    2.1.9 GUS检测  36
    2.1.10 LacZ染色  36
    2.1.11 外源硝酸盐的处理  36
    2.1.12 乙烯处理  36-37
    2.1.13 生长素及生长素抑制剂的处理  37
    2.1.14 嫁接试验  37
    2.1.15 RNA的提取,cDNA第一链的合成和RT-PCR  37-38
  2.2. 结果与分析  38-55
    2.2.1 rel3突变体的共生表型筛选  38-40
    2.2.2 rel3突变体在共生和非共生条件下的结瘤表型分析  40-41
    2.2.3 rel3突变体接种植株的固氮酶活力测定  41-42
    2.2.4 REL3时空表达模式的分析  42-44
    2.2.5 野生型与rel3突变体根瘤发育过程的侵染事件  44-45
    2.2.6 外源硝酸盐对rel3突变体结瘤的影响  45-46
    2.2.7 rel3突变体对乙烯敏感性的分析  46-48
    2.2.8 生长素及生长素抑制剂对rel3突变体结瘤的影响  48-50
    2.2.9 rel3突变体与野生型嫁接试验的分析  50-54
    2.2.10 rel3突变体背景下HAR1基因的表达分析  54-55
  2.3 结论与讨论  55-59
    2.3.1 鉴定了一个根瘤数目减少的共生突变体rel3  55
    2.3.2 REL3对根瘤的起始起着重要的作用  55-56
    2.3.3 REL3的突变不影响氮和乙烯对结瘤的负调控作用  56
    2.3.4 REL3的突变影响了生长素的极性运输  56-57
    2.3.5 REL3与HAR1间存在相互作用  57-59
参考文献  59-72
附录  72-80
致谢  80-81
作者简介  81-82
导师评阅表  82

Ta-siRNA途径调控百脉根根瘤发育的研究

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