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拟南芥CK1A基因功能初步分析

作　者: 喻达时
导　师: 郭新红
学　校: 湖南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 拟南芥 CK1A基因酵母双杂交表达分析原核表达
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 43次
引　用: 1次
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内容摘要

酪蛋白激酶(casein kinase, CK)是一类具有独特理化特性的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,广泛存在于酵母、哺乳动物等真核生物中,主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜及细胞骨架等部位,参与了细胞的多种生物学过程,在机体的生命活动中扮演着举足轻重的角色。在高等植物中对CK的性质及作用的研究不多,对它们在植物中的生理功能所知甚少。因此对该家族中的基因进行生理功能研究具有重要的意义。在本研究中,利用Clustal W软件对CK家族基因的蛋白序列进行比对,构建了该基因家族成员的生物系统进化树。本研究主要对CK家族中的CK1A基因的生理功能进行了初步分析。首先对CK1 A的氨基酸序列进行了功能域预测和分析。根据www.arabidopsis.org网站提供的基因组序列,得到了CK1A翻译起始密码子上游963bp的片段,并利用植物启动子顺式作用元件分析网站plantCARE的在线分析工具对CK1A基因上游963bp的调控区域片段进行分析。结果发现CK1A基因的调控区域存在大量与光相关的调控元件如ATCT-motif, G-box, Box 4, Box 1,同时还发现了很多与胁迫诱导相关的元件。因此推测CK1A基因的转录很可能受光信号及环境胁迫的诱导,最终表达的蛋白很有可能参与光信号及胁迫信号的转导。将CK1A基因克隆到植物表达载体GW-GFP的35S启动子下游与GFP融合,从而成功构建了GW-GFP-CK1A载体,并采用基因枪法将该载体导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达,发现CK1A基因的表达蛋白主要集中在细胞核上。酵母双杂交结果显示CK1A蛋白在蓝光下能与CRY2蛋白发生相互作用,暗示CK1A基因可能参与拟南芥的蓝光信号传导途径。为了深入探讨CK1A基因的功能,采用半定量RT-PCR分析了其表达特征。结果表明：CK1A基因在花中表达量最高,其次是茎和根,在叶和叶柄中表达量较弱。蓝光能诱导CK1A基因转录水平升高,光照12 h时表达量明显增加,光照24 h后表达量下降。同时利用原核表达载体pColdTF对CK1A基因编码蛋白进行了大肠杆菌表达,并检测到了重组蛋白的表达。这些数据为进一步深入研究CK1A基因的生理功能提供了有价值的参考资料。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
缩略词  11-13
第1章绪论  13-22
  1.1 蛋白激酶  13-16
    1.1.1 蛋白激酶概述  13
    1.1.2 蛋白激酶的种类与分类  13-15
    1.1.3 蛋白激酶活性调节  15-16
      1.1.3.1 蛋白激酶自身磷酸化对激酶活性调节  15-16
      1.1.3.2 蛋白激酶相互磷酸化对激酶活性的调节  16
      1.1.3.3 调节剂对蛋白激酶活性的调节  16
  1.2 酪蛋白激酶  16-20
    1.2.1 酪蛋白激酶概述  16-17
    1.2.2 酪蛋白激酶CK1  17-20
      1.2.2.1 哺乳动物和酵母中CKl家族成员概述和分类  17-19
      1.2.2.2 CK1蛋白的结构和功能  19-20
  1.3 本论文研究目的、意义与内容  20-22
    1.3.1 研究目的与意义  20
    1.3.2 研究背景与内容  20-22
第2章拟南芥CK1A基因的生物信息学分析  22-34
  2.1 材料与方法  22-23
    2.1.1 实验材料  22
    2.1.2 实验方法  22-23
      2.1.2.1 CK1A转录调控区域元件分析  22
      2.1.2.2 CK1A的氨基酸序列的同源性分析  22-23
      2.1.2.3 CK1A蛋白的一级结构分析  23
      2.1.2.4 CK1A蛋白的三级结构分析  23
  2.2 结果与讨论  23-33
    2.2.1 CK1A基因的转录调控区域元件分析  23-26
    2.2.2 拟南芥CK1A氨基酸序列的同源性分析  26-27
    2.2.3 拟南芥CK1A蛋白的一级结构分析  27-31
      2.2.3.1 CK1A蛋白的信号肽序列分析  27-28
      2.2.3.2 CK1A蛋白跨膜结构域的预测  28
      2.2.3.3 CK1A蛋白亲疏水性分析  28-29
      2.2.3.4 CK1A蛋白修饰位点预测  29-31
    2.2.4 拟南芥CK1A蛋白的三级结构预测  31-33
  2.3 小结  33-34
第3章拟南芥CK1A基因的表达及功能分析  34-43
  3.1 材料与方法  34-40
    3.1.1 实验材料  34-35
      3.1.1.1 材料  34
      3.1.1.2 酶和试剂  34-35
      3.1.1.3 仪器  35
    3.1.2 实验方法  35-40
      3.1.2.1 拟南芥总DNA的提取  35
      3.1.2.2 总RNA提取及逆转录反应  35-36
      3.1.2.3 引物设计  36
      3.1.2.4 PCR条件的优化  36-37
      3.1.2.5 半定量RT-PCR  37-38
      3.1.2.6 35S-GW-GFP-CK1A融合表达载体的构建  38-39
      3.1.2.7 洋葱表皮细胞定位检测  39-40
  3.2 结果与讨论  40-42
    3.2.1 拟南芥CK1A基因的表达特异性分析及细胞定位  40-41
    3.2.2 CK1A:GFP融合表达载体的构建及瞬时表达分析  41-42
  3.3 小结  42-43
第4章 CK1A蛋白的原核表达与酵母双杂交分析  43-55
  4.1 材料与方法  43-50
    4.1.1 实验材料  43-45
      4.1.1.1 材料  43-44
      4.1.1.2 酶和试剂  44-45
      4.1.1.3 仪器  45
    4.1.2 实验方法  45-50
      4.1.2.1 CK1A基因片段的制备  45
      4.1.2.2 pCold表达载体的制备  45
      4.1.2.3 大肠杆菌DH5a和BL21 star感受态细胞的制备  45-46
      4.1.2.4 质粒对大肠杆菌的转化  46
      4.1.2.5 酶切和连接反应  46-47
      4.1.2.6 蛋白诱导表达  47
      4.1.2.7 表达产物的可溶性检测  47
      4.1.2.8 表达产物的SDS-PAGE分析  47-48
      4.1.2.9 高效酵母转化方法  48-49
      4.1.2.10 滤纸显色检测  49
      4.1.2.11 Prey载体的构建  49
      4.1.2.12 Bait载体的构建  49-50
  4.2 结果与讨论  50-54
    4.2.1 CK1A基因片段的克隆与的原核表达载体的构建  50-51
    4.2.2 CK1A原核表达产物的SDS-PAGE检测  51-52
    4.2.3 与CRY2相互作用蛋白的初步筛选  52
    4.2.4 与CRY2相互作用的基因克隆及酵母双杂交载体构建  52
    4.2.5 筛库结果的酵母双杂交验证分析  52-54
  4.3 小结  54-55
结论  55-57
参考文献  57-63
附录A:攻读学位期间所发表的学术论文目录  63-64
致谢  64

拟南芥CK1A基因功能初步分析

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