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重组核糖核酸酶A的表达和复性研究

作　者: 肖文楚
导　师: 董晓燕
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 核糖核酸酶A 表达金属螯合色谱组氨酸标签复性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 45次
引　用: 2次
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内容摘要

核糖核酸酶A(Ribonuclease A,EC3.1.27.5,RNase A)在DNA的制备、抑制病毒复制及作为基础研究中的模型蛋白等方面具有广泛的用途和需求,但商品化的RNase A都是从动物的胰脏中分离提纯得到,这不仅限制了其大量获取,而且造成流程复杂,生产成本高。因此利用基因工程手段大量获取具有生物活性的RNase A已成为研究的热点。目前文献报道中RNase A的表达多通过可溶的形式表达,表达量少,这限制了其工业化生产和应用。基于此,本研究利用PCR技术从牛胰脏的基因组中扩增出RNase A的编码序列,将其插入到带组氨酸标签的高效表达质粒pET28a中,然后利用E.coli BL21(DE3)以包含体的形式高效表达,之后利用稀释法和金属螯合色谱法(IMAC)对包含体进行了复性,为其工业化应用提供理论基础和实验依据。研究结果表明,利用PCR技术从牛胰脏的基因组中扩增出RNase A编码基因,测序结果表明其与组织DNA的同源性为100%;将此目标基因插入到载体pET28a中后,转入E.coli BL21(DE3)宿主菌中,得到pET28a-RNase A基因工程表达菌;RNase A基因的插入没有影响基因工程菌的生长规律,经过诱导,发现目标蛋白主要以包含体的形式表达;目标蛋白最优的表达条件为:培养菌的OD600为0.4时(约需培养2 h,此时菌体处于对数生长前期)开始诱导表达,IPTG浓度为1 mM,诱导3 h,此条件下RNase A包含体的表达量为60 mg/L培养液;包含体经过脲、表面活性剂和PE缓冲液的洗涤,最终目标蛋白的纯度达到83%。RNase A包含体存在最佳的变性时间(1 h);稀释复性仅可以使低浓度的蛋白(≤0.1 mg/mL)获得较好的复性效果(复性24 h,活性收率为52%);IMAC法可使蛋白质终浓度为0.5 mg/mL的RNase A复性24 h后达到80%的活性收率,同时实现了RNase A包含体的纯化(复性产物的纯度为97%)。与稀释复性相比,在相同的蛋白终浓度(0.5 mg/mL)下,IMAC法复性收率较稀释复性提高了近60个百分点,产物纯度也提高了14个百分点。此外,通过圆二色光谱对复性产物进行的分析结果表明。复性的RNase A与天然RNase A具有类似的高级结构。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章文献综述  8-22
  1.1 核糖核酸酶 A 简介  8-12
    1.1.1 RNase A 的结构和理化性质  8-9
    1.1.2 RNase A 的生理功能和用途  9-10
    1.1.3 RNase A 的活性检测  10-11
    1.1.4 RNase A 的研究现状  11-12
  1.2 包含体蛋白质的体外复性  12-20
    1.2.1 蛋白质复性的基本原理  13-14
    1.2.2 体外复性难点及策略  14-15
    1.2.3 一般的复性方法  15-18
    1.2.4 金属螯合色谱辅助复性  18-20
  1.3 本文主要研究目的和内容  20-22
第二章 RNase A 重组菌株的构建及表达  22-45
  2.1 实验材料  22-24
    2.1.1 菌种和载体  22-23
    2.1.2 工具酶及分子量参照物  23
    2.1.3 主要化学试剂  23
    2.1.4 主要仪器  23-24
    2.1.5 引物设计与合成  24
  2.2 实验方法  24-30
    2.2.1 目的基因的获取  24-26
    2.2.2 重组质粒的构建  26-28
    2.2.3 重组子阳性菌落的筛选  28-30
  2.3 目的蛋白的诱导表达  30-34
    2.3.1 基因工程菌生长曲线的测定  30
    2.3.2 重组蛋白的诱导表达  30-32
    2.3.3 表达产物的 SDS-PAGE 电泳检测  32-33
    2.3.4 蛋白质含量的测定  33-34
  2.4 结果与讨论  34-43
    2.4.1 pET28a-RNase A 重组质粒构建  34-38
    2.4.2 RNase A 的表达  38-43
  2.5 本章小结  43-45
第三章 RNase A 包含体的复性  45-58
  3.1 实验材料和设备  45-47
    3.1.1 实验材料  45-46
    3.1.2 实验设备  46-47
  3.2 实验方法  47-50
    3.2.1 RNase A 测活标准曲线的绘制及活性收率的计算  47-48
    3.2.2 RNase A 包含体的变性溶解  48
    3.2.3 RNase A 包含体的稀释复性  48
    3.2.4 RNase A 包含体的IMAC 复性和纯化  48-50
    3.2.5 复性RNase A的圆二色光谱分析  50
  3.3 实验结果及讨论  50-57
    3.3.1 RNase A 包含体的稀释复性  50-53
    3.3.2 RNase A 包含体的IMAC 复性  53-56
    3.3.3 复性RNase A 的结构分析  56-57
    3.3.4 IMAC 复性与稀释复性的比较  57
  3.4 本章小结  57-58
第四章结论与展望  58-60
  4.1 结论  58
  4.2 展望  58-60
附录  60-70
参考文献  70-74
致谢  74

重组核糖核酸酶A的表达和复性研究

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