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南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建
作 者: 王金慧
导 师: 丁燏
学 校: 广东海洋大学
专 业: 水产养殖
关键词: 南极冰藻 谷胱甘肽过氧化物酶 谷胱甘肽硫转移酶 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 克隆 生物信息学 原核表达
分类号: Q943.2
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)与谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase, GST)是谷胱甘肽抗氧化系统中的重要酶类,能够清除体内H2O2和许多有机氢过氧化物,并且具有解毒功能。S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, SAHH)是一种细胞内广泛存在的酶,在调节生物体转甲基化反应中占据重要地位。本实验通过RT-PCR及RACE-PCR技术成功克隆了南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L GPx、GST和SAHH基因全长,分别命名为ICE-LGPx、ICE-LGST和ICE-LSAHH,并对其做了全面的生物信息学分析。还研究了ICE-LGPx和ICE-LGST基因在不同盐度和CdCl2作用前后的表达变化并构建了ICE-LGPx和ICE-LGST基因的原核表达载体。ICE-LGPx基因全长1956 bp,编码255个氨基酸。预测分子量为28.3 KD,理论等电点为9.07。ICE-LGPx基因在进化上与绿藻类如Micromonas sp. RCC299和Micromonas pusilla亲缘关系较为相近。在序列3’非编码区末端有一102 bp的SECIS (硒代半胱氨酸插入序列)元件。ICE-LGPx基因的三维结构模拟结果显示该蛋白含有5个α螺旋和7个β折叠;ICE-LGST基因的全长966 bp,编码321个氨基酸。推导其分子量为24.1 KD,理论等电点为9.69。ICE-LGST基因与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)线粒体GST同源性最高,蛋白质亚细胞定位预测结果同样显示ICE-LGST基因可能来源于线粒体。三维结构显示ICE-LGST亚基共有9个α-螺旋和4个β-折叠,并且具有两个基本功能域:GSH结合位点和底物结合位点;ICE-LSAHH全长1844 bp,编码487个氨基酸。预测的分子量为53 KD,等电点为5.16。氨基酸的同源比对分析表明SAHH是一个进化上比较保守的蛋白,与其他物种SAHH基因具有较高的同源性。系统进化树结果显示ICE-LSAHH与杜氏盐藻(Dunaliella salina)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小球藻(Chlorella variabilis)等有较近亲缘关系。三维结构显示其亚基共有20个α-螺旋和12个β-折叠,并且由3个结构域组成:大的N端底物结合域、NAD结合域和C端域。应用实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR),以ICE-Lβ-actin和ICE-L GAPDH基因为内参照,研究了ICE-LGPx和ICE-LGST基因在不同盐度和不同浓度CdCl2 (μmol·L-1)作用前后的表达变化。结果表明,在不同NaCl浓度胁迫作用下ICE-LGPx和ICE-LGST基因均有表达,且呈先上升后下降的趋势。ICE-LGPx在盐度11和66时,24 h达到表达量最大值;在盐度22和99时,12 h达到表达量最大值。ICE-LGST在低盐度11和22时,24 h达到最大表达量,在高盐度99时12 h表达量最大。ICE-LGST基因对重金属镉的响应高于ICE-LGPx。ICE-LGPx基因在CdCl2浓度为10和20μmol·L-1时,表达量最大值分别出现在48 h和24 h;CdCl2浓度为30和40μmol·L-1时在12 h时即达到最大值。ICE-LGST基因在CdCl2浓度为10和20μmol·L-1时,表达量最大值分别出现在36 h和48 h;CdCl2浓度为30和40μmol·L-1时表达量最大值分别出现在36 h和12 h。选用了pET-28a原核表达载体,将南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L GPx基因和GST基因与其连接,成功地构建了原核表达载体pET28-GPx与pET28-GST。
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全文目录
摘要 6-8Abstract 8-131 前言 13-23 1.1 南极冰藻 13-16 1.1.1 南极冰藻的生长环境 13-14 1.1.2 南极冰藻的国内外研究现状及生态学意义 14 1.1.3 南极冰藻的应用前景 14-16 1.1.4 展望 16 1.2 谷胱甘肽的性质及生理功能 16 1.3 谷胱甘肽过氧化物酶 16-19 1.3.1 动物谷胱甘肽过氧化物酶的分类和结构 17 1.3.2 谷胱甘肽过氧化物酶的生物学功能 17-18 1.3.3 植物中的谷胱甘肽过氧化物酶 18-19 1.4 谷胱甘肽硫转移酶 19-20 1.4.1 谷胱甘肽硫转移酶的分类和结构 19-20 1.4.2 谷胱甘肽硫转移酶的生物学功能 20 1.5 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 20-22 1.5.1 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的基本结构 21 1.5.2 SAHH 的国内外研究进展 21-22 1.6 研究目的及意义 22-23 1.6.1 研究目的 22 1.6.2 研究意义 22-232 GPx、GST 和SAHH 全长基因的克隆及序列分析 23-56 2.1 材料 23-25 2.1.1 藻种来源 23 2.1.2 质粒与受体菌 23 2.1.3 主要仪器设备 23-24 2.1.4 主要工具酶及试剂盒 24 2.1.5 主要溶液和试剂的配制 24-25 2.2 实验方法 25-35 2.2.1 冰藻的培养 25 2.2.2 南极冰藻总RNA 的提取 25 2.2.3 感受态细胞的制备 25-26 2.2.4 南极冰藻GPx、GST、SAHH 基因的RACE 克隆 26-35 2.2.5 生物信息学分析 35 2.3 结果与分析 35-52 2.3.1 总RNA 的质量鉴定 35-36 2.3.2 3’RACE cDNA 一链的合成 36 2.3.3 ICE-LGPx 基因的克隆结果与分析 36-42 2.3.4 ICE-LGST 基因的克隆结果与分析 42-47 2.3.5 ICE-LSAHH 基因的克隆结果及分析 47-52 2.4 讨论 52-56 2.4.1 ICE-LGPx 基因 52-54 2.4.2 ICE-LGST 基因 54 2.4.3 ICE-LSAHH 基因 54-563 南极冰藻在不同条件下的差异表达研究 56-62 3.1 试剂及仪器 56 3.2 实验方法 56-58 3.2.1 引物设计 56-57 3.2.2 实验设计 57 3.2.3 总RNA 的DNase Ⅰ消化 57 3.2.4 扩增效率的确定 57-58 3.2.5 荧光定量PCR 58 3.2.6 数据统计与分析 58 3.3 结果与分析 58-60 3.3.1 ICE-LGPx 和ICE-LGST 基因在不同CdCl_2浓度下的表达分析 58-59 3.3.2 ICE-LGPx 与ICE-LGST 基因在不同盐度下的表达分析 59-60 3.4 讨论 60-624 原核表达载体的构建 62-72 4.1 实验材料 62-63 4.1.1 藻种与培养条件 62 4.1.2 质粒与受体菌 62 4.1.3 主要工具酶及试剂盒 62 4.1.4 主要试剂 62 4.1.5 主要仪器 62-63 4.2 实验方法 63-68 4.2.1 重组表达质粒pET28-GPx 的构建 63-66 4.2.2 重组表达质粒pET28-GST 的构建 66-68 4.3 实验结果 68-70 4.3.1 重组表达质粒pET28-GPx 的构建 68-69 4.3.2 重组表达质粒pET28-GST 的构建 69-70 4.4 讨论 70-725 结论 72-74 5.1 Chlamydomonas sp. ICE-LGPX 基因的克隆 72 5.2 Chlamydomonas sp. ICE-LGST 基因的克隆 72 5.3 Chlamydomonas sp. ICE-LSAHH 基因的克隆 72 5.4 ICE-LGPX 与ICE-LGST 差异表达分析 72-73 5.5 原核表达载体的构建 73-74参考文献 74-85致谢 85-86附录 86-87作者简介 87-89导师简介 89
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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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