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基于RNA测序技术的马氏珠母贝珍珠囊转录组及数字基因表达谱分析

作 者: 赵晓霞
导 师: 杜晓东
学 校: 广东海洋大学
专 业: 海洋生物学
关键词: 马氏珠母贝 珍珠囊 RNA测序 转录组 数字基因表达谱
分类号: Q786
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


本文以我国海水珍珠的主要生产贝类——马氏珠母贝(Pinctada martensii)的珍珠囊为研究对象,构建了1个转录组文库和6个不同发育时期的数字基因表达谱(Digital gene expression, DGE)文库,运用新兴的RNA高通量测序(RNA-seq)技术对构建的文库开展测序、组装和生物信息学分析。同时,利用荧光实时定量PCR技术(Real-time PCR, qRT-PCR)扩增免疫和矿化相关基因在6个不同发育阶段的表达变化规律,以达到验证测序分析的目的。对转录组文库测序,得到39,400,004条原始reads,总核苷酸数为3,546,000,360nt。其中,GC含量、Q20和未知碱基的百分比分别为42.94%、94.65%和0.01%。对原始reads进行拼接组装,得到102,762条Unigene,其中有46,387个功能完整的各种长度编码区域被识别,且这些Unigene编码的蛋白大多数都超过了200个氨基酸。这些转录本中,大约有23,081条Unigene可能参与了219个已知的代谢或信号通路。与Nr数据库、Swissprot数据库、GO分类和COG数据库比对,分别有36,989、30,592、7,700和10,414个转录本被注释或分类,COG分类揭示有447个转录本的功能目前尚未被报道。已注释的转录本中有453条Unigene与无脊椎动物免疫基因相关,103条与生物矿化基因相关。对珍珠囊发育第5、10、15、20、30和60天的DGE文库测序,得到的原始Tag均为5,000,000,去除杂质标签后得到Clean Tag分布在250万到340万之间,平均占总Tag数的94.91%;六个DGE数据库能够比对到转录组数据库中的Clean Tag占总Clean Tag的26.32%,即在珍珠囊发育的6个时期中,一些高表达的基因在转录组文库中没有出现。珍珠囊发育的第5、10、15、20和30天的表达谱与第60天的相比,分别有2192、1902、2108、1475和1368个差异表达基因,尤其是在第15天差异表达基因数目有明显增加的趋势。与转录组文库比较分析发现,在153条与免疫相关的Unigene中,30条在珍珠囊不同发育时期有显著差异表达(P<0.05),它们分别编码溶菌酶、Toll样受体、碱性磷酸酶、清道夫受体、酸性磷酸酶和凝集素等蛋白;在103条与生物矿化相关的Unigene中,13条在珍珠囊发育不同时期有显著差异表达(P<0.05),它们分别编码皮连蛋白、酪氨酸类似蛋白、perlwapin、钙调素蛋白家族等蛋白。从有显著差异表达的Unigene中选择与免疫和矿化相关的基因各一个,进行荧光定量PCR验证实验。结果表明,溶菌酶基因在珍珠囊发育前30天的表达水平处于较低的水平,在第30天表达显著上调,然后开始下调,第60天时表达水平基本恢复到原来状态。皮连蛋白基因在珍珠囊发育的前20天没有明显的差异表达,第30天时该基因发生显著上调,直到第60天该基因的表达基本保持了较高的水平。荧光定量对这两个基因表达的分析结果与DGE检测的表达趋势基本一致,从而验证了DGE检测的准确性。本研究的结果丰富了马氏珠母贝cDNA数据资源,不仅为探讨马氏珠母贝免疫防御相关基因和矿化相关基因的作用机理和调控机制奠定了坚实的基础,同时也为马氏珠母贝的遗传育种和人工育珠的生产实践提供理论指导。

全文目录


摘要  6-8Abstract  8-121 前言  12-21  1.1 马氏珠母贝的研究进展  12-16    1.1.1 马氏珠母贝的遗传育种  12-13    1.1.2 马氏珠母贝珍珠囊的研究  13-14    1.1.3 马氏珠母贝的免疫防御机制  14-15    1.1.4 珍珠形成相关蛋白/基因的研究  15-16  1.2 RNA-seq 的研究进展  16-20    1.2.1 RNA-seq 的原理  16-18    1.2.2 RNA-seq 的应用  18-19    1.2.3 海洋生物RNA-seq 的研究进展  19-20  1.3 研究的目的和意义  20-212. 马氏珠母贝育珠贝珍珠囊转录组分析  21-43  2.1 引言  21  2.2 材料与方法  21-28    2.2.1 实验用贝  21    2.2.2 实验仪器  21-22    2.2.3 实验试剂  22    2.2.4 实验方法  22-28  2.3 实验结果  28-40    2.3.1 总RNA 质量检测结果  28-29    2.3.2 测序数据组装的结果  29-33    2.3.3 组装数据的功能注释结果  33-40  2.4 讨论  40-43    2.4.1 珍珠囊转录组文库分析  40    2.4.2 珍珠囊转录组基因注释分析  40-41    2.4.3 珍珠囊发育免疫和矿化相关基因的筛选  41-433 马氏珠母贝不同发育时期珍珠囊DGE 分析  43-75  3.1 引言  43  3.2 实验材料与方法  43-50    3.2.1 实验用贝  43    3.2.2 实验仪器  43    3.2.3 实验试剂  43-44    3.2.4 实验方法  44-50  3.3 实验结果  50-69    3.3.1 总RNA 质量的检测结果  50-51    3.3.2 测序结果  51-56    3.3.3 珍珠囊发育不同时期差异基因表达分析  56-68    3.3.4 荧光定量实验结果  68-69  3.4 讨论  69-75    3.4.1 马氏珠母贝DGE 数据分析  69-70    3.4.2 马氏珠母贝免疫基因差异表达分析  70-72    3.4.3 马氏珠母贝矿化基因差异表达分析  72-754 结论  75-76参考文献  76-87致谢  87-88作者简介  88-89导师简介  89

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程) > 基因的表达
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