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Pin1在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞周期的影响

作　者: 周路
导　师: 杨曙光
学　校: 泰山医学院
专　业: 内科学
关键词: 多肽脯氨酰基顺反异构酶 骨肉瘤 细胞增殖 腺病毒表达载体 细胞周期 细胞周期素D
分类号: R738.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的肿瘤的发生是在基因和蛋白水平上多步骤、多因素的过程,最终导致不可控制的细胞增殖、转化和死亡。蛋白质丝/苏-脯氨酸位点的磷酸化在细胞周期的调控及转化过程中起到关键的作用。Pin1是一种肽基脯氨酰顺反异构酶,它拥有两个功能结构区,一个为肽基脯氨酰异构酶活性区,可以催化蛋白质异构功能;另一个为色氨酸-色氨酸结构区,可以介导Pin1结合底物中磷酸化的丝/苏-脯氨酸位点。Pin1通过与磷酸化的丝/苏-脯氨酸位点结合,引起蛋白质构像改变,使其活化。Pin1引起的构像改变对于其作用底物p53,cyclinD1,C-Jun,NF-κB,C-myc,E2F以及β-catenin等众多癌因子都有催化活性,因此在细胞周期的进展,亚细胞核内转录定位,RNA的合成和细胞生长及分化的调控中都起着重要作用。目前国内外关于Pinl在人骨肉瘤组织中的表达情况及其与cyclinD1的相互关系的研究甚少,本实验通过研究人骨肉瘤和正常骨组织中的Pin1和cyclniD1的表达情况,旨在探讨Pin1在骨肉瘤发生发展中的意义。方法1.采用免疫组织化学染色及Western Blot对25例人骨肉瘤中Pin1蛋白水平的表达进行检测。2.应用PCR技术克隆出包含hPin1基因编码区的cDNA,并将克隆出来的cDNA片段插入pENTR载体中。应用pAd/CMV/V5-DEST试剂盒将目的基因Pin1转染入腺病毒载体中,并通过DNA自动化测序进行测定。3.对人骨肉瘤细胞系Saos-2及U2-OS进行Pin1腺病毒转染,并应用及其抑制剂胡桃醌进行处理,收集处理后细胞,用MTT法观测处理后细胞生长曲线;用流式细胞仪观测细胞周期变化;用Western-Blot法检测Pin1及其底物蛋白cyclinD1的表达。结果1. 25例骨肉瘤组织中Pin1表达率为72%,对照组中未见其表达;应用Western- Blot法检测,结果显示骨肉瘤组织中Pin1及cyclinD1、β-catenin均有增高。2.经PCR扩增的Pin1的cDNA经测序与基因文库一致,并可将其重组入腺病毒进行表达,重组克隆转染HEK293A细胞扩增后提纯病毒,此病毒可感染细胞并表达Pin1。3. Pin1病毒转染后能促进细胞生长,并促进细胞周期进展。4.Pin1可以促cyclinD1、cyclinE、CDK4和CDK6的表达,Pin1抑制剂胡桃醌可以对Pin1的功能起抑制作用结论Pin1及cyclinD1在人骨肉瘤组织中表达明显高于正常组织, Pin1与细胞生长及细胞周期的进展有密切关系并且可以导致cyclinD1的升高。Pin1可能与人骨肉瘤的发生与发展有关,有望成为骨肉瘤治疗的新靶点。

全文目录


中文摘要  4-6ABSTRACT  6-8符号说明  8-9前言  9-12材料与方法  12-23结果  23-26讨论  26-30结论  30-31附图  31-42参考文献  42-46综述  46-54  参考文献  49-54致谢  54

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 运动系肿瘤 > 骨骼肿瘤
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