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拟南芥胱硫醚-γ-合成酶(D-AtCGS)基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备
作 者: 王义鹏
导 师: 许艳丽
学 校: 东北林业大学
专 业: 微生物学
关键词: 蛋氨酸 胱硫醚-γ-合成酶 原核表达 转基因植物检测
分类号: Q943.2
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
蛋氨酸作为含硫必需氨基酸,具有重要的生理功能。它不仅是蛋白质的构成成分,而且是mRNA翻译的起始氨基酸。其下游产物硫腺苷甲硫氨酸是生物体内最重要的甲基供体,同时还具有转硫、转氨丙基的作用;其衍生物硫甲基甲硫氨酸是重要的硫转运分子,与生物硫代谢密切相关。蛋氨酸能促进动物身体及毛发生长,对肝脏有保护作用,并参与血球素的形成。缺乏时会引起食欲减退,体重迅速下降,还可引发脂肪肝、卵磷脂缺乏、毛发变质、肌肉萎缩和贫血等现象。人和非类反刍动物不能自身合成蛋氨酸,只能依靠日常膳食摄取,但目前主要作物的蛋氨酸含量普遍较低,大豆作为优质蛋白来源,蛋氨酸含量仅占种子总蛋白的1.1%-1.6%。现有大豆品种资源蛋氨酸含量遗传变异相当有限,给通过常规育种方法培育高蛋氨酸品种带来了很大限制,转基因技术的出现,为该问题的解决提供了新的途径。胱硫醚-Y-合成酶(Cystathionine-γ-synthase, CGS)是蛋氨酸合成的关键酶,它催化O-酸高丝氨酸(O-phospho-L-homoserine, OPH)形成胱硫醚,胱硫醚在胱硫醚-β-裂合酶、甲硫氨酸合成酶和S-腺苷甲硫氨酸合成酶的作用下,最终生成蛋氨酸。CGS与TS的Km值相近,对OPH的利用效率取决于这两种酶的含量。大量的研究表明CGS的表达受到底物的反馈抑制。因此,在利用基因工程手段进行调控时,需对CGS基因的分子结构进行改造,减少底物反馈抑制作用。对拟南芥CGS的研究表明.其N端99-128位的30个氨基酸与催化作用无关,将其删除后反馈抑制作用明显减弱,过量表达这种N端删除的CGS基因更利于培育蛋氨酸含量提高的转基因植物。本实验室用N端删除的AtCGS基因(D-AtCGS)转化大豆及豆科模式植物百脉根,进行蛋氨酸合成调控研究及高蛋氨酸大豆的分子育种,目前已成功获得了多个转基因株系。本实验以N端删除的AtCGS基因D-AtCGS为目的基因,构建原核表达载体,对D-AtCGS进行了原核表达,制备了抗血清,并利用制备的抗血清对本实验获得的多种转D-AtCGS基因大豆材料和都可模式植物百脉根进行了Western blot及ELISA检测,结果表明转基因植株的检测信号明显高于野生型对照,最终成功的建立了D-AtCGS转基因植物的免疫学检测方法,本研究可为植物CGS表达调控研究及大豆和其他作物的CGS转基因植株检测提供理想的技术支持。
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全文目录
摘要 4-5Abstract 5-91 绪论 9-15 1.1 蛋氨酸的生理功能 9 1.2 胱硫醚-γ-合成酶(Cystathionine-γ-synthase,CGS)与蛋氨酸的合成调控 9-11 1.2.1 蛋氨酸在植物体内的合成 9-10 1.2.2 CGS与蛋氨酸的合成调控 10 1.2.3 拟南芥CGS基因的分子结构 10-11 1.3 转基因工程提高植物蛋氨酸含量的方法与途径 11-12 1.4 外源基因原核表达的流程与应用领域 12-13 1.4.1 外源基因基因原核表达的一般流程 12 1.4.2 原核表达的应用领域 12-13 1.5 免疫学技术在转基因植物检测中的应用 13 1.6 本研究的目的和意义 13-152 D-AtCGS原核表达载体的构建 15-26 2.1 材料与方法 15-23 2.1.1 实验材料 15-18 2.1.1.1 实验载体 15-17 2.1.1.2 菌株 17 2.1.1.3 试剂药品及配制方法 17-18 2.1.1.4 实验仪器 18 2.1.2 实验方法 18-22 2.1.2.1 PUC-118-D-AtCGS中间载体的获得 18-22 2.1.3 PET28a-D-AtCGS、PET32a-D-AtCGS、PGEX-4t-1-D-AtCGS原核表达载体的构建 22-23 2.2 结果与分析 23-25 2.2.1 PUC118-D-AtCGS中间载体的验证 23 2.2.2 PET28a-D-AtCGS、PET32a-D-AtCGS、PGEX-4t-1-D-AtCGS原核表达载体的验证 23-25 2.2.2.1 PET28a-D-AtCGS原核表达载体的验证 23-24 2.2.2.2 PET32a-D-AtCGS原核表达载体的验证 24-25 2.2.2.3 PGEX-4T-1-D-AtCGS原核表达载体的验证 25 2.3 本章小结 25-263 At-DCGS蛋白的表达纯化与抗血清制备 26-41 3.1 材料与方法 26-35 3.1.1 实验材料 26-30 3.1.1.1 菌株 26 3.1.1.2 主要仪器设备 26 3.1.1.3 主要化学药品 26-27 3.1.1.4 主要药品的配制方法 27-30 3.1.2 实验方法 30-35 3.1.2.1 At-DCGS的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测 30-32 3.1.2.2 重组蛋白的Western blot检测 32 3.1.2.3 最佳诱导条件的确定 32-33 3.1.2.4 At-DCGS重组蛋白的纯化 33-34 3.1.2.5 Bradford法检测蛋白的浓度检测 34 3.1.2.6 纯化蛋白的缓冲液置换的超滤浓缩 34-35 3.2. 结果与分析 35-40 3.2.1 PET28a-D-AtCGS、PET32a-D-AtCGS、PGEX-4t-1-D-tCGS原核表 达载体表达效率的比较 35-36 3.2.2 重组蛋白的Western blot检测 36 3.2.3 最佳诱导条件的确定 36-37 3.2.3.1 最佳诱导时间的确定 36-37 3.2.3.2 最佳诱导剂剂量的确定 37 3.2.4 重组蛋白表达形式的检测 37-38 3.2.5 D-AtCGS重组蛋白的纯化 38-39 3.2.5.1 包涵体的洗涤与溶解 38 3.2.5.2 不同浓度咪唑洗洗脱液对蛋白提取的影响 38-39 3.2.6 蛋白浓度的Bradford法测定 39-40 3.3 本章小结 40-414 At-DCGS抗血清在转基因植物检测方面的应用 41-51 4.1. 材料与方法 41-46 4.1.1 实验材料 41-42 4.1.1.1 主要试剂 41 4.1.1.2 实验药品配制方法 41-42 4.1.1.3 主要仪器 42 4.1.1.4 植物材料 42 4.1.2. 实验方法 42-46 4.1.2.1 AT-DCGS抗血清的免疫反应检测 42-43 4.1.2.2 AT-DCGS抗血清的效价检测 43 4.1.2.3 AT-DCGS抗血清IgG粗提 43 4.1.2.4 转基因植物的PCR检测 43-44 4.1.2.5 D-ATCGS抗血清的初步应用 44-46 4.2 结果与分析 46-50 4.2.1 AT-DCGS抗血清的免疫反应检测 46 4.2.2 AT-DCGS抗血清的效价检测 46-47 4.2.3 AT-DCGS抗血清IgG的粗提 47 4.2.4 转基因植物的PCR检测 47-48 4.2.5 转基因植物的免疫学检测 48-50 4.3 本章小结 50-51结论 51-52参考文献 52-55攻读学位期间发表的学术论文 55-56致谢 56-57
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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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