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兔—人嵌合型抗-HEV IgM质控物及耐RNase病毒样颗粒的双质粒双表达研究

作　者: 张括
导　师: 李金明；王露楠
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 酶联免疫吸附试验 质控物 兔-人抗体交联物 戊型肝炎病毒 耐核糖核酸酶病毒样颗粒 包装位点 MS2噬菌体 双质粒表达系统
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


第一部分兔-人嵌合型戊型肝炎病毒IgM抗体质控物的构建目的本研究拟用化学交联方法构建一种兔-人嵌合型戊型肝炎病毒（Hepatitis Evirus,HEV）IgM抗体作为抗-HEV IgM检测质控物。方法基因重组蛋白NE2作为抗原免疫家兔,获得兔抗-HEV IgG,酶免方法检测其滴度和活性后,蛋白A亲合层析纯化IgG,十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分析IgG纯度,紫外分光光度计测定260/280nm吸光度并计算抗体浓度。EDC（1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride,1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺）交联兔抗-HEV IgG与人IgM。抗-HEV IgM酶联免疫测定（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA）试剂盒同时检测嵌合抗体和阳性血清,并比较两者滴度。嵌合抗体稀释后,放置于不同温度条件下,保存不同时间后,ELISA检测稳定性。结果未纯化的兔抗-HEV IgG滴度为1∶100,000,纯化后,SDS-PAGE电泳结果显示轻链和重链两条带（25kD和50kD）,没有杂带,达到电泳纯,抗体浓度达10mg/ml。嵌合抗体与人抗.HEV IgM阳性血清滴度均为1∶160,说明其同抗原的亲和性与真实的人类样本相似。稳定性实验表明,此嵌合抗体在室温、4℃可至少保存两个月,而在较低温度如-20℃、-70℃和反复冻融条件下不稳定。结论本研究用化学交联方法成功构建了抗-HEV IgM嵌合抗体质控物,在国内外尚属首次,其克服了传统血清质控物的缺点,根据已建立起的方法,可以构建一系列应用于免疫测定检测不同病毒特异IgM抗体的阳性质控物。第二部分双质粒双表达构建内含长片段RNA的病毒样颗粒目的本研究拟通过改变大肠杆菌噬菌体MS2-RNA 19mer茎环结构（包装位点,pac site）的数量、位置和亲和力,构建能够表达内含长片段嵌合体RNA耐核糖核酸酶病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）的双质粒原核表达系统,探讨茎环结构在表达内含更长片段RNA的VLPs时所起的作用。方法利用pET-28b和pACYCDuet-1构建两种双质粒表达系统,质粒之一为本室已经构建好的内含MS2成熟酶蛋白和衣壳蛋白的质粒pET-MC。另一质粒的构建方法分别如下:（1）设计均含有PacI酶切位点的上下游引物,且下游引物含有茎环结构的突变体（C-variant）,扩增HIV gag序列,单酶切连接目的序列与表达载体pACYC-3V（内含3段SARS-CoV基因、C-variant、1段HCV基因和2段H5N1基因）,构建重组载体pACYC-3V-gag。（2）设计均含有PacI酶切位点的上下游引物,且下游引物含有茎环结构的突变体,扩增HIV gag序列,单酶切连接目的序列和表达载体pACYC-pol（内含HIV pol序列及一个C-variant）,构建重组载体pACYC-pol-gag。双质粒共转化入表达菌株BL21（DE3）。IPTG诱导表达,超声碎菌,DNaseⅠ和RNase A双酶消化,氯化铯密度梯度离心,超声处理液透析过夜后丙烯葡聚糖凝胶层析纯化得到VLPs。电镜观察后RT-PCR验证包装外源RNA的长度。结果成功构建了重组载体pACYC-3V-gag和pACYC-pol-gag并得到两VLPs。丙烯葡聚糖凝胶层析纯化后,VLPs OD260（0.3）高于OD280（0.15）。DNaseⅠ和RNase A双酶消化结果表明,所包装的RNA具有耐RNase和DNase消化的特性。RT-PCR验证第一种VLPs中包装了2,698bp的目的序列,第二种VLPs逆转录后扩增出了pol和gag的部分片段,分别为600bp和450bp,间接说明VLPs能够包装3,250bp的外源RNA。结论本研究将MS2 RNA突变型包装位点的数量增加至两个并改变其在外源RNA中的位置,利用双质粒双表达系统可表达内含2.7～3.2kb外源RNA片段的耐RNase的VLPs,初步阐明了包装位点的数量和位置在外源RNA包装中的作用。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-12
第一部分 兔-人嵌合型戊型肝炎病毒IgM抗体质控物的构建  12-33
  1 材料与方法  14-22
  2 结果  22-26
  3 讨论  26-29
  4 参考文献  29-33
第二部分 双质粒双表达构建内含长片段RNA的病毒样颗粒  33-70
  1 材料与方法  35-50
  2 结果  50-62
  3 讨论  62-65
  4 参考文献  65-70
全文结论  70-71
论文综述  71-93
  一 戊型肝炎及其质控物研究进展  71-79
  二 RNA噬菌体病毒样颗粒包装机制及其应用  79-93
附录  93-107
  一 英文缩略语表  93-95
  二 个人简历  95-96
  三 载体图  96-98
    1 pET-28b(+)质粒及克隆位点图  96-97
    2 pACYCDuet-1质粒及克隆位点图  97-98
  四 测序图  98-107
    1 gagT-A克隆后SP6方向测序图  98-99
    2 单酶切连接T7-TER方向测序图  99-100
    3 T-1T7方向测序图  100-101
    4 T-2 T7方向测序图  101-102
    5 T-3 T7方向测序图  102-103
    6 T-3 SP6方向测序图  103-104
    7 gag T-A克隆后T7方向测序图  104-105
    8 单酶切连接T7-TER方向测序图  105-106
    9 gag T-A克隆后SP6方向测序图  106-107
致谢  107

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 免疫学检验
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