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拟南芥热激因子HSFA1d响应甲醛胁迫的作用研究

作　者: 张道君
导　师: 陈丽梅
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 甲醛污染 热激因子HSFAld 过量表达 甲醛抗性
分类号: Q945.78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目前,甲醛污染对环境和人类健康的危害已引起人们高度的重视,有研究表明植物具有修复甲醛污染的能力,但植物对甲醛胁迫响应基因的报道却很少。然而,本实验前期的工作研究表明,AtHsfA1d是模式植物拟南芥中一个甲醛胁迫响应转录因子,即甲醛(2 mM)处理拟南芥表达谱的分析,随着时间的延长,热激因子表达量增加,我们认为可能HSF参与了甲醛的胁迫。因此,本实验以AtHsfA1d为研究的切入点,考察AtHsfA1d的甲醛胁迫响应作用,主要研究结果如下：1.通过对4 mM甲醛、4 mM甲酸以及4 mM甲醇胁迫下AtHsfA1d的表达谱分析,再次表明了拟南芥AtHsfA1d是甲醛胁迫的上调表达基因。2.制备AtHsfA1d的特异性抗体,以备后续实验的检测工作。从拟南芥中提取了总RNA,反转录PCR扩增获得ΔC-AtHsfA1d基因片段(AtHsfA1d的特异片段),通过TA克隆、酶切、测序后连接到原核表达载体pET32a(+)上,成功构建了pET32a(+)-ΔC-AtHsfA1d重组质粒,转化大肠杆菌基因工程菌BL21中进行目的蛋白的诱导表达。随后考察IPTG诱导浓度、温度、诱导时间,最终确定了ΔC-AtHsfA1d重组蛋白的最佳表达条件为诱导浓度为0.5 mM IPTG.诱导温度为28℃以及诱导时间是8 h,且SDS-PAGE显示表达形式以可溶性表达为主,通过对ΔC-AtHsfA1d重组蛋白的亲和纯化以及割胶回收获得相对较纯的ΔC-AtHsfA1d重组蛋白,浓度为1 mg/mL,总含量为2 mg,作为抗原用于抗体的制备,抗体免疫结果显示蛋白的血清效价达到10-5。3.为了鉴定在甲醛胁迫下,AtHSFA1d基因在酿酒酵母中的表达与功能分析,我们构建了酵母表达载体pYES3-AtHsfA1d采用电转化转化质粒pYES3-AtHsfA1d进入酿酒酵母感受态细胞并通过菌落PCR检测,然后比较转基因酵母菌株和非转基因酵母菌株在甲醛(0 mM,1 mM,1.5 mM,2 mM,4 mM,6 mM)胁迫下的生长状况,发现转基因的酵母菌株在非生物甲醛胁迫条件下的存活菌落数高于非转基因的酵母菌株,尤其在含有4 mM甲醛的平板上,原始酵母菌株只有在起始浓度(OD600=2.0)时才有所生长,其余浓度均未生长,而转基因菌株生长良好,这初步证明AtHsfA1d具有增强酵母菌对非生物甲醛胁迫抵抗力的功能。4.为了考察甲醛胁迫下,AtHsfA1d对烟草的甲醛耐受性的影响,我们利用Gateway技术构建植物表达载体pK2GW7-AtHsfA1d电转化转化质粒pK2GW7-AtHsfA1d进入农杆菌感受态细胞pPMP90,再通过农杆菌的介导最终将pK2GW7-AtHsfA1d转化到无菌烟草的叶片中,经过共培养之后,转移到MS4抗性筛选培养基上,得到烟草的抗性愈伤组织和抗性芽,将抗性芽转到MS抗性培养基上以获得烟草转基因植株。通过基因组水平,转录水平以及蛋白表达水平检测最终获得正确的转基因烟草。PCR检测结果显示,转AtHsfA1d的烟草基因组和cDNA,都能扩增出一条大小为1458 bp的条带,与质粒阳性对照一致、蛋白表达水平检测结果也显示,转基因烟草的蛋白可作为抗原,与ΔC-AtHsfA1d抗体互相识别。这些都表明AtHsfA1d基因已整合到烟草基因组中。随后考察野生型和转基因烟草在4mM甲醛下吸收速率以及6 mM甲醛下鲜重和总蛋白的对比,发现在4 mM甲醛处理下,转基因烟草对甲醛吸收速率比野生型烟草快；在6 mM甲醛下,转基因烟草增加的鲜重约是野生型植物的2倍,生理指标显示转基因烟草的总蛋白含量有所上升,这些表明拟南芥热激因子AtHsfA1d提高了烟草的甲醛耐受性。

全文目录


摘要  4-6ABSTRACT  6-8目录  8-11插图和附表清单  11-13缩略词  13-14第一章 前言  14-30  1.1 甲醛的危害性以及防治措施  14-15    1.1.1 甲醛的性质及其危害性  14    1.1.2 甲醛危害性的防治措施  14-15  1.2 甲醛毒性机理及其胁迫应答基因  15-16    1.2.1 甲醛毒性机理  15-16    1.2.2 甲醛胁迫应答基因  16  1.3 热激因子的概述  16-17  1.4 植物热激因子的结构和分类  17-19    1.4.1 植物热激因子的结构和分类  17-18    1.4.2 植物热激因子的结构域的特征  18-19  1.5 热激因子的调节作用  19-23    1.5.1 HSF对HSP的调节机制  19-20    1.5.2 HSF的磷酸化调节  20-21    1.5.3 HSF对非HSP的调节机制  21-22    1.5.4 HSF参与热激和氧化,通路是否有交叉性  22-23  1.6 A类热激因子的研究进展  23-26    1.6.1 A类热激因子的表达与耐热性的获得  23-25    1.6.2 HSF对转录因子的调控产生对胁迫的耐受性  25    1.6.3 A类热激因子在种子发育中的作用  25-26    1.6.4 拟南芥AtHSFA6a的定位研究  26    1.6.5 A类热激因子DNA结合位点的研究  26  1.7 B类、C类热激因子及HSF1的研究进展  26-27  1.8 HSFs分子水平研究其协调作用  27-28  1.9 本研究的主要内容和意义  28-30    1.9.1 本研究的主要内容  28-29    1.9.2 本研究的意义  29-30第二章 材料与方法  30-48  2.1 材料  30-34    2.1.1 菌株和质粒  30-31    2.1.2 植物材料  31    2.1.3 主要试剂  31    2.1.4 主要仪器  31    2.1.5 主要培养基配方  31-34  2.2 实验方法  34-48    2.2.1 引物合成  34    2.2.2 引物稀释  34    2.2.3 分子克隆技术  34-41    2.2.4 植物遗传转化(农杆菌介导法)  41-42    2.2.5 目的蛋白重组菌的构建表达与蛋白纯化方法  42-45    2.2.6 甲醛胁迫下HSFA1d的表达谱分析  45-46    2.2.7 酿酒酵母感受态细胞的制备及其电转化表达载体到酿酒酵母  46    2.2.8 植物吸收液体甲醛检测  46-47    2.2.9 植物对甲醛的吸收与抗性分析  47-48第三章 结果与分析  48-72  3.1 甲醛胁迫下拟南芥HSFA1d的表达谱分析  48-49  3.2 △C-AtHSFA1d重组蛋白的制备与抗体制备  49-58    3.2.1 pET32a(+)-△C-AtHSFA1d原核表达载体的构建  49-54    3.2.2 △C-AtHSFA1d重组蛋白的原核表达  54-57    3.2.3 △C-AtHSFA1d重组蛋白抗体制备的效价结果  57-58  3.3 AtHSFA1d基因在酵母中的表达与功能分析  58-63    3.3.1 pYES3-AtHSFA1d酵母表达载体的构建流程  58    3.3.2 pYES3-AtHSFA1d表达载体的构建  58-61    3.3.3 良酒酵母遗传转化  61-62    3.3.4 pYES3-AtHSFA1d在酿酒酵母的功能鉴定  62-63  3.4 AtHSFA1d基因在转基因烟草中的过量表达与功能分析  63-72    3.4.1 pK_2GW_7-AtHSFA1d表达载体的构建策略  63-64    3.4.2 pK_2GW_7-AtHSFA1d表达载体的构建  64-66    3.4.3 烟草遗传转化  66-67    3.4.4 PCR检测目的基因在烟草中的整合情况  67    3.4.5 目的基因的转录水平检测  67-68    3.4.6 目的基因的蛋白表达水平检测  68    3.4.7 转基因烟草的甲醛吸收速率检测  68-69    3.4.8 转基因烟草对甲醛的吸收与抗性分析  69-72第四章 讨论  72-76  4.1 热激因子AtHSFA1d的作用探讨  72-73  4.2 目的蛋白在宿主菌的表达情况分析  73-74  4.3 转基因植物表达水平高低的讨论  74-76第五章 总结与展望  76-77致谢  77-78参考文献  78-88附录A 攻读硕士期间发表论文及获得奖项  88

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生理学 > 协迫生理学
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