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条纹斑竹鲨和鲫鱼BAFF基因的克隆和性质分析

作　者: 庞书英
导　师: 任文华
学　校: 南京师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 条纹斑竹鲨(Chilosoyllium plagiosum) 鲫鱼(Carassius auratus) BAFF 克隆 体外表达 生物信息
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本论文共分为4个部分：1.综述近年来B淋巴细胞刺激因子(BAFF)的研究进展。2.探讨鱼类BAFF基因研究的意义。3.通过RT-PCR和RACE技术,从条纹斑竹鲨鱼(Chiloscyllium plagiosum)脾脏组织中扩增得到B淋巴细胞刺激因子(CpBAFF)的全长cDNA序列。CpBAFF由272个氨基酸组成,与其它脊椎动物BAFF相同,CpBAFF氨基酸序列中也含有一个跨膜区和一个弗林酶切位点。CpBAFF与其它已知的硬骨鱼类斑马鱼、大西洋鲑鱼、斑点绿河豚、三刺鱼、彩虹胡瓜鱼和虹鳟鱼在氨基酸水平上的相似性分别为36%,40%,43%,45%,47%和57%。Real time PCR实验表明BAFF主要存在于条纹斑竹鲨的免疫器官脾脏和肾脏中。在大肠杆菌BL21 (DE3)中高效表达了带有His6标签的重组可溶性CpsBAFF,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫转印检测鉴定。目的蛋白CpsBAFF经Ni 2+-IMAC纯化后,在体外可刺激B细胞存活,并呈剂量依赖性。CpBAFF是从软骨鱼中获得的第一个BAFF分子,而且是目前克隆到的最原始的BAFF基因,这对研究脊椎动物免疫因子的进化有着重要意义。4.通过RT-PCR和RACE技术,从鲫鱼(Carassius auratus)脾脏组织中扩增得到B淋巴细胞刺激因子的全长cDNA序列(CaBAFF)。CaBAFF cDNA全长1639 bp,包括408 bp的5端非编码区、438 bp的3端非编码区和795 bp的开放读码框(编码242个氨基酸)。与已知其它BAFF一样,其氨基酸序列中也含有一个跨膜区和TNF结构域。Blast分析表明,CaBAFF与斑马鱼、彩虹胡瓜鱼、大西洋鲑鱼、虹鳟鱼和斑点绿河豚分别有77%、66%、59%、59%和47%的氨基酸序列同源性。同时利用分子生物学软件分析了鲫鱼CaBAFF蛋白质的基本性质。本实验为继续研究BAFF基因在鲫鱼中的生物学功能及与免疫的关系奠定了基础。

全文目录


摘要  5-7Abstract  7-9前言  9-10第一章 B淋巴细胞刺激因子(BAFF)的研究进展  10-19  1.1 BAFF的基因和蛋白质结构特点  10-11  1.2 BAFF组织分布  11-12  1.3 BAFF的受体及信号通路  12-15    1.3.1 BAFF的受体及其结构  12-13    1.3.2 BAFF介导的信号通路  13-15  1.4 BAFF的生物学功能  15-17    1.4.1 对B细胞的作用  15-16    1.4.2 对T细胞的作用  16-17  1.5 BAFF与相关疾病  17-18    1.5.1 BAFF与自身免疫性疾病  17    1.5.2 BAFF与感染的关系  17    1.5.3 BAFF与免疫缺陷  17-18    1.5.4 BAFF与恶性肿瘤发生的关系  18  1.6 结语与展望  18-19第二章 鱼类BAFF基因研究意义  19-22  2.1 脊椎动物BAFF基因的分子克隆  19  2.2 脊椎动物BAFF基因的生物学功能  19  2.3 鱼类的进化地位  19-20  2.4 研究对象介绍  20-21    2.4.1 条纹斑竹鲨  20    2.4.2 鲫鱼  20-21  2.5 本研究的目的意义  21-22第三章 条纹斑竹鲨BAFF基因的cDNA克隆、序列分析、体外表达及生物学活性鉴定  22-53  3.1 实验材料  22-25    3.1.1 实验动物、质粒和宿主菌  22    3.1.2 试剂和耗材  22-23    3.1.3 实验仪器  23-24    3.1.4 主要试剂配制  24-25  3.2 试验方法  25-35    3.2.1 组织样品总RNA的抽提  25    3.2.3 简并引物设计  25-26    3.2.4 RT-PCR扩增CpBAFF保守片段  26-28    3.2.5 cDNA末端快速扩增(RACE)  28-30    3.2.6 CpBAFF全长cDNA序列的拼接和鉴定  30    3.2.7 Real-time PCR比较CpBAFF组织表达差异  30-31    3.2.8 CpBAFF cDNA序列的生物信息学分析  31    3.2.9 重组表达载体的构建  31-33    3.2.10 重组CpsBAFF的表达、鉴定和纯化  33-35    3.2.11 重组CpsBAFF的生物活性测定  35  3.3 实验结果  35-51    3.3.1 CpBAFF全长cDNA序列和推测的氨基酸序列  35-36    3.3.2 CpBAFF编码区的扩增  36-37    3.3.3 CpBAFF同源序列比对  37    3.3.4 系统发生分析  37-39    3.3.5 CpBAFF在各个组织中表达的定量分析  39    3.3.6 CpBAFF蛋白基本性质的信息学分析  39-50    3.3.7 重组蛋白的表达、纯化和鉴定  50    3.3.8 重组CpsBAFF蛋白对小鼠B细胞的促存活作用  50-51  3.4 讨论  51-53第四章 鲫鱼BAFF基因的克隆和性质分析  53-72  4.1 实验材料  53-54    4.1.1 组织样本  53    4.1.2 菌种和质粒  53    4.1.3 试剂和耗材  53    4.1.4 主要实验仪器  53-54    4.1.5 主要试剂配制  54  4.2 实验方法  54-58    4.2.1 组织样品总RNA的抽提  54    4.2.2 简并引物设计  54    4.2.3 RT-PCR扩增CaBAFF保守片段  54-56    4.2.4 cDNA末端快速扩增(RACE)  56-58    4.2.5 CaBAFF全长cDNA序列的拼接和鉴定  58    4.2.6 CaBAFF cDNA序列的生物信息学分析  58  4.3 实验结果  58-71    4.3.1 鲫鱼CaBAFF基因全长cDNA序列和推测的氨基酸序列  58-59    4.3.2 CaBAFF编码区的扩增  59-60    4.3.3 CaBAFF蛋白同源序列比对  60    4.3.4 系统发生分析  60-62    4.3.5 CaBAFF蛋白质基本性质的生物信息学分析  62-68    4.3.6 结构功能域分析与Motif搜索  68-69    4.3.7 空间结构预测  69-71  4.4 讨论  71-72全文总结  72-73参考文献  73-80硕士在读期间研究成果  80-81致谢  81

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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