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hBMP4和hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究

作 者: 邓春梅
导 师: 张彦定
学 校: 福建师范大学
专 业: 发育生物学
关键词: rhBMP4 rhBMP7 CHO细胞 外源蛋白表达
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs)是一类属于TGF-p超家族的蛋白质生长因子,主要活性形式是糖基化的同源或者异源二聚体。它能够使未分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞并具有形成骨组织的能力。众多的BMPs都具有诱骨活性,其中以BMP4和BMP7的诱骨活性最强。后来的研究发现BMPs不仅具有骨诱导活性,还能够调节细胞的生长、增殖和分化,同时BMPs对脑、肾脏、肝脏、泌尿系统等组织器官的决定和分化起重要作用。在国内学者们主要利用大肠杆菌或者毕赤酵母表达系统来表达rhBMPs,这些表达系统具有操作简单、产量高成本低等优点,但是表达产物的结构不同于天然蛋白。所以本实验尝试利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞表达hBMP4和hBMP7。主要研究工作包括:①hBMP4和hBMP7重组表达载体的构建,然后电转染CHO/DG44细胞株,基因组PCR和RT-PCR鉴定基因的整合和转录。②表达产物经过初步纯化WESTERN-BLOT分析表明rhBMP4存在二聚体和单体。③氨甲喋呤逐步加压扩增目的基因,rhBMP4表达量提高了2倍,测得表达量为330ng/ml。④有限稀释法筛选高表达细胞株,rhBMP4表达量达到了583ng/ml。⑤通过碱性磷酸酶活性测定实验证明纯化后的rhBMP4具有生物活性。⑥DOT-BLOT和ELISA分析表明hBMP7重组表达质粒电转染CHO/DG44细胞后能够表达rhBMP7。

全文目录


中文摘要  2-3Abstract  3-4中文文摘  4-7目录  7-10绪论  10-20  1 CHO细胞表达系统概述  10-15    1.1 真核生物蛋白常用表达系统的比较  10-11    1.2 CHO细胞表达系统简介  11-15  2 BMPs的研究概况  15-20    2.1 BMPs的结构特征  15-16    2.2 BMPs的信号传递  16-17    2.3 BMPs与器官发育  17    2.4 BMPs与骨诱导  17-18    2.5 BMPs的临床应用研究  18-19    2.6 BMPs的重组表达研究  19-20第一章 实验材料与方法  20-34  1.1 实验材料  20-24    1.1.1 菌株、质粒和细胞  20    1.1.2 主要试剂  20-21    1.1.3 主要仪器  21    1.1.4 常用培养基和缓冲液  21-23    1.1.5 寡聚核苷酸引物  23-24  1.2 实验方法  24-34    1.2.1 质粒小提  24    1.2.2 PCR反应  24-25    1.2.3 限制性内切酶酶切质粒  25    1.2.4 细胞基因组的提取  25-26    1.2.5 细胞总RNA的提取  26    1.2.6 RT-PCR  26    1.2.7 hBMP4和hBMP7重组表达质粒的构建  26-28    1.2.8 质粒中量提取(Qiagen-tip100试剂盒提取)  28    1.2.9 CHO/DG44细胞的培养  28-29    1.2.10 NIH3T3细胞的培养  29    1.2.11 细胞计数  29    1.2.12 重组CHO/DG44细胞株的构建  29-30    1.2.13 表达产物的DOT-BLOT分析  30-31    1.2.14 表达产物的WESTERN-BLOT分析  31    1.2.15 表达产物的分离纯化  31-32    1.2.16 hBMP4多拷贝表达盒的扩增  32    1.2.17 ELISA方法定量分析rhBMP4  32    1.2.18 有限稀释筛选高表达细胞株  32-33    1.2.19 纯化后的rhBMP4生物活性测定  33-34第二章 实验结果  34-48  2.1 hBMP4在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究  34-43    2.1.1 hBMP4重组表达质粒的构建  34    2.1.2 hBMP4重组CHO/DG44细胞株的构建  34-36    2.1.3 rhBMP4在重组CHO/DG44细胞中的表达检测  36-37    2.1.4 表达产物的初步纯化及鉴定  37-38    2.1.5 hBMP4多拷贝表达盒的扩增及表达量的测定  38-40    2.1.6 有限稀释法筛选高表达细胞株  40-42    2.1.7 纯化后的rhBMP4生物活性鉴定  42-43  2.2 hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究  43-48    2.2.1 hBMP7重组表达质粒的构建  43-44    2.2.2 hBMP7重组CHO/DG44细胞株的构建  44-45    2.2.3 hBMP7在重组CHO/DG44细胞中的表达检测  45-48第三章 分析与讨论  48-52  3.1 重组表达载体的构建  48-49  3.2 转染效率  49  3.3 重组细胞中hBMP4的表达产物分析  49-50  3.4 多拷贝表达盒的扩增  50  3.5 有限稀释法筛选高表达细胞株  50-51  3.6 rhBMP4的活性鉴定  51-52第四章 结论  52-54附录  54-58参考文献  58-64攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  64-66致谢  66-68个人简历  68-69

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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