学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
hBMP4和hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究
作 者: 邓春梅
导 师: 张彦定
学 校: 福建师范大学
专 业: 发育生物学
关键词: rhBMP4 rhBMP7 CHO细胞 外源蛋白表达
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 4次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs)是一类属于TGF-p超家族的蛋白质生长因子,主要活性形式是糖基化的同源或者异源二聚体。它能够使未分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞并具有形成骨组织的能力。众多的BMPs都具有诱骨活性,其中以BMP4和BMP7的诱骨活性最强。后来的研究发现BMPs不仅具有骨诱导活性,还能够调节细胞的生长、增殖和分化,同时BMPs对脑、肾脏、肝脏、泌尿系统等组织器官的决定和分化起重要作用。在国内学者们主要利用大肠杆菌或者毕赤酵母表达系统来表达rhBMPs,这些表达系统具有操作简单、产量高成本低等优点,但是表达产物的结构不同于天然蛋白。所以本实验尝试利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞表达hBMP4和hBMP7。主要研究工作包括:①hBMP4和hBMP7重组表达载体的构建,然后电转染CHO/DG44细胞株,基因组PCR和RT-PCR鉴定基因的整合和转录。②表达产物经过初步纯化WESTERN-BLOT分析表明rhBMP4存在二聚体和单体。③氨甲喋呤逐步加压扩增目的基因,rhBMP4表达量提高了2倍,测得表达量为330ng/ml。④有限稀释法筛选高表达细胞株,rhBMP4表达量达到了583ng/ml。⑤通过碱性磷酸酶活性测定实验证明纯化后的rhBMP4具有生物活性。⑥DOT-BLOT和ELISA分析表明hBMP7重组表达质粒电转染CHO/DG44细胞后能够表达rhBMP7。
|
全文目录
中文摘要 2-3Abstract 3-4中文文摘 4-7目录 7-10绪论 10-20 1 CHO细胞表达系统概述 10-15 1.1 真核生物蛋白常用表达系统的比较 10-11 1.2 CHO细胞表达系统简介 11-15 2 BMPs的研究概况 15-20 2.1 BMPs的结构特征 15-16 2.2 BMPs的信号传递 16-17 2.3 BMPs与器官发育 17 2.4 BMPs与骨诱导 17-18 2.5 BMPs的临床应用研究 18-19 2.6 BMPs的重组表达研究 19-20第一章 实验材料与方法 20-34 1.1 实验材料 20-24 1.1.1 菌株、质粒和细胞 20 1.1.2 主要试剂 20-21 1.1.3 主要仪器 21 1.1.4 常用培养基和缓冲液 21-23 1.1.5 寡聚核苷酸引物 23-24 1.2 实验方法 24-34 1.2.1 质粒小提 24 1.2.2 PCR反应 24-25 1.2.3 限制性内切酶酶切质粒 25 1.2.4 细胞基因组的提取 25-26 1.2.5 细胞总RNA的提取 26 1.2.6 RT-PCR 26 1.2.7 hBMP4和hBMP7重组表达质粒的构建 26-28 1.2.8 质粒中量提取(Qiagen-tip100试剂盒提取) 28 1.2.9 CHO/DG44细胞的培养 28-29 1.2.10 NIH3T3细胞的培养 29 1.2.11 细胞计数 29 1.2.12 重组CHO/DG44细胞株的构建 29-30 1.2.13 表达产物的DOT-BLOT分析 30-31 1.2.14 表达产物的WESTERN-BLOT分析 31 1.2.15 表达产物的分离纯化 31-32 1.2.16 hBMP4多拷贝表达盒的扩增 32 1.2.17 ELISA方法定量分析rhBMP4 32 1.2.18 有限稀释筛选高表达细胞株 32-33 1.2.19 纯化后的rhBMP4生物活性测定 33-34第二章 实验结果 34-48 2.1 hBMP4在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究 34-43 2.1.1 hBMP4重组表达质粒的构建 34 2.1.2 hBMP4重组CHO/DG44细胞株的构建 34-36 2.1.3 rhBMP4在重组CHO/DG44细胞中的表达检测 36-37 2.1.4 表达产物的初步纯化及鉴定 37-38 2.1.5 hBMP4多拷贝表达盒的扩增及表达量的测定 38-40 2.1.6 有限稀释法筛选高表达细胞株 40-42 2.1.7 纯化后的rhBMP4生物活性鉴定 42-43 2.2 hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究 43-48 2.2.1 hBMP7重组表达质粒的构建 43-44 2.2.2 hBMP7重组CHO/DG44细胞株的构建 44-45 2.2.3 hBMP7在重组CHO/DG44细胞中的表达检测 45-48第三章 分析与讨论 48-52 3.1 重组表达载体的构建 48-49 3.2 转染效率 49 3.3 重组细胞中hBMP4的表达产物分析 49-50 3.4 多拷贝表达盒的扩增 50 3.5 有限稀释法筛选高表达细胞株 50-51 3.6 rhBMP4的活性鉴定 51-52第四章 结论 52-54附录 54-58参考文献 58-64攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 64-66致谢 66-68个人简历 68-69
|
相似论文
- 纺织用化学品对体外细胞增殖抑制影响的研究,TS195.1
- PBDE-209对卵巢癌及仓鼠卵巢上皮细胞体外增殖的影响,R737.31
- 三类非离子表面活性剂对细胞增殖抑制作用的研究,R114
- 过表达热休克蛋白70提高CHO细胞表达抗体的能力,Q78
- 重组长效EPO(NESP)高效表达细胞株的构建,Q78
- 重组乙肝表面S抗原在CHO-K1细胞中的表达、克隆筛选,R392
- 一些虫生真菌菌丝体中抗肿瘤活性物质筛选和结构鉴定研究,R284
- 真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CLEC2的构建及其在CHO细胞中的表达,Q78
- 日本脑炎病毒核心蛋白编码基因重组质粒构建及鉴定,R512.32
- 促糖尿病溃疡愈合细胞/材料三维复合物的研制及应用基础研究,R318.08
- 人源肝癌单链抗体基因真核表达质粒的构建、表达,R735.7
- 白细胞介素-12在中国仓鼠卵巢细胞中的表达及其生物学活性的测定,R965
- 人分泌型KL蛋白在CHO细胞中的稳定表达,Q789
- CD59基因突变与糖尿病血管病变的相关性研究,R587.2
- 人CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA MBL基因突变体在哺乳细胞中的表达及产物分析,R392
- 人骨保护素哺乳类表达载体的构建及初步表达,R346
- 重组人膜型Klotho蛋白在CHO细胞中的稳定表达,R346
- Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的表达与鉴定及CHO细胞对PMA反应的某些特点,R392
- 电离辐射致中国仓鼠卵巢(CHO)细胞凋亡,Q25
- 硫芥诱导淋巴细胞凋亡作用及其机理初步研究,R363
中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
© 2012 www.xueweilunwen.com
|