学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌筛选及特性研究

作　者: 刘金辉
导　师: 喻子牛；李明顺
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 苏云金芽胞杆菌甘薯茎线虫杀线虫活性筛选克隆表达
分类号: S435.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 37次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

甘薯茎线虫病是制约我国甘薯生产的三大严重病害之一,近年来已成为北方薯区最严重的病害。传统防治甘薯茎线虫病的方法主要有轮作换茬、药剂防治和选育抗病品种等,但因其高投入低效率和产生的环境问题而暴露出很大的局限性。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)由于其特异性的高毒力、对人畜无害和不污染环境等特点,作为农业生产上防治植物寄生线虫的微生物杀虫剂已得到一定应用,但是到目前为止利用Bt防治甘薯茎线虫的研究却未见公开报道。本研究以已经报道的对一些动植物寄生线虫有活性的Bt菌株为供试菌株,筛选得到了对甘薯茎线虫具有高毒力的YBT-008菌株,利用SDS-PAGE、LC-MS和PCR等方法验证了YBT-008可编码的四个杀虫晶体蛋白基因cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba,进而构建重组载体并使其表达,最后分别测定了已表达蛋白对甘薯茎线虫的杀虫活性,旨在寻找到杀甘薯茎线虫的Bt新型基因和蛋白资源。1.筛选了一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008。初筛以已经报道的对动植物寄生线虫有活性的12株Bt菌株为供试菌株,提取其杀虫晶体蛋白,分别测定在3d和7d时对供试线虫的致死率；初筛得到了三株对供试线虫致死率在50%以上的Bt菌株；将其生测样品稀释两倍后,按同样方法进行生物测定,此为复筛。通过初筛和复筛我们得到了一株对甘薯茎线虫具有高毒力的Bt菌株YBT-008,相较其余菌株杀虫效果明显,其对甘薯茎线虫的LC50值为203.76μg/mL。2.验证了YBT-008可编码的四个杀虫晶体蛋白基因。镜检观察到YBT-008在芽胞形成过程中可形成具明显形态特征的伴胞晶体蛋白,通过SDS-PAGE和LC-MS分析,鉴定出YBT-008可产生Cry4Aa、Cry4Ba、Cry11Aa和Cyt2Ba四种杀虫晶体蛋白：设计特异性引物对,对上述四个杀虫晶体蛋白基因的PCR扩增进步验证了YBT-008基因组内含有cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba杀虫晶体蛋白基因。3.克隆并表达了cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba四个杀虫晶体蛋白基因。设计带酶切位点的特异性引物扩增上述四个基因的全长编码序列,将其连接到穿梭载体pHT304上,并转化到Bt无晶体突变株BMB171中,镜检和SDS-PAGE结果表明上述四个蛋白均已获得表达。4.检测了Cyt2Ba和Cry4Ba对甘薯茎线虫的杀虫活性。提取上述表达成功的晶体蛋白,分别检测了其对甘薯茎线虫的杀虫活性,结果表明Cyt2Ba在3d和7d时的杀虫效果明显,Cry4Ba的杀虫效果并不明显；因Cry11Aa和Cry4Aa的表达量不高,因此其表达系统还有待于进一步的优化,然后再检测其杀虫活性。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略语表  11-13
1 文献综述  13-28
  1.1 甘薯茎线虫病及其防治  13-19
    1.1.1 引言  13-14
    1.1.2 甘薯茎线虫病的发生与分布  14-15
    1.1.3 甘薯茎线虫的生物学特性  15
    1.1.4 甘薯茎线虫的侵染机制和危害症状  15-16
    1.1.5 植物寄生线虫的综合防治  16-19
      1.1.5.1 化学防治  16-17
      1.1.5.2 物理防治  17
      1.1.5.3 生物防治  17-19
  1.2 苏云金芽胞杆菌及其杀虫晶体蛋白基因的表达调控  19-23
    1.2.1 苏云金芽胞杆菌简介  19
    1.2.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白及其编码基因  19-20
    1.2.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的表达调控  20-22
      1.2.3.1 转录水平的调控  21
      1.2.3.2 转录后水平的调控  21-22
      1.2.3.3 翻译后水平的调控  22
    1.2.4 影响cry基因表达的几个其他因素  22-23
      1.2.4.1 基因拷贝数  22-23
      1.2.4.2 cry基因之间的协同作用  23
      1.2.4.3 宿主细胞的影响  23
  1.3 苏云金芽胞杆菌防治植物寄生线虫研究进展  23-27
    1.3.1 苏云金芽胞杆菌对植物寄生线虫的杀虫活性  23-24
    1.3.2 苏云金芽胞杆菌的杀线虫基因和产物  24-25
    1.3.3 苏云金芽胞杆菌对线虫的作用机制  25-27
      1.3.3.1 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对昆虫的作用机制  25-26
      1.3.3.2 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白对线虫的作用机制研究  26-27
  1.4 研究的目的和意义  27-28
2 材料和方法  28-38
  2.1 实验材料  28-30
    2.1.1 菌株来源  28-29
    2.1.2 PCR引物  29-30
    2.1.3 培养基  30
    2.1.4 抗生素及使用浓度  30
    2.1.5 供试线虫  30
  2.2 试剂和仪器  30-32
    2.2.1 试剂  30
    2.2.2 常用缓冲液和溶液  30-31
    2.2.3 仪器  31-32
  2.3 实验方法  32-38
    2.3.1 供试苏云金芽胞杆菌的培养  32
    2.3.2 苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的SDS-PAGE  32
      2.3.2.1 电泳样品的制备  32
      2.3.2.2 晶体蛋白的SDS-PAGE  32
    2.3.3 苏云金芽胞杆菌生物测定样品的制备  32-33
    2.3.4 晶体蛋白样品的浓度测定  33
    2.3.5 甘薯茎线虫的接种、培养和收集  33-34
      2.3.5.1 甘薯茎线虫的接种和培养  33
      2.3.5.2 甘薯茎线虫的收集  33-34
    2.3.6 对甘薯茎线虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌筛选  34
      2.3.6.1 初筛  34
      2.3.6.2 复筛  34
    2.3.7 DNA操作方法  34-35
      2.3.7.1 大肠杆菌质粒的抽提  34-35
      2.3.7.2 苏云金芽胞杆菌质粒的抽提  35
    2.3.8 DNA的体外重组操作  35-38
      2.3.8.1 PCR扩增操作  35
      2.3.8.2 酶切反应  35-36
      2.3.8.3 连接反应  36
      2.3.8.4 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备与热激转化  36
      2.3.8.5 BMB171感受态细胞的制备和电转化  36-38
3 结果与分析  38-56
  3.1 甘薯茎线虫的接种、培养和收集  38-39
  3.2 对甘薯茎线虫具有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌筛选  39-44
    3.2.1 苏云金芽胞杆菌供试菌株  39-41
    3.2.2 供试苏云金芽胞杆菌的初筛  41-43
    3.2.3 供试苏云金芽胞杆菌的复筛  43
    3.2.4 YBT-008对甘薯茎线虫的LC_(50)测定  43-44
  3.3 YBT-008杀虫晶体蛋白基因的鉴定和验证  44-49
    3.3.1 YBT-008的生物学特性  44-45
    3.3.2 YBT-008晶体蛋白的SDS-PAGE  45-46
    3.3.3 YBT-008的LC-MS及结果分析  46
    3.3.4 YBT-008杀虫晶体蛋白基因的PCR验证  46-49
  3.4 YBT-008杀虫晶体蛋白基因的克隆与表达  49-54
    3.4.1 cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba重组表达载体的构建  50-52
      3.4.1.1 cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba全长编码序列的PCR扩增  51-52
      3.4.1.2 cyt2Ba、cry11Aa、cry4Aa和cry4Ba与pHT304载体的连接  52
    3.4.2 重组载体的表达验证  52-54
  3.5 重组表达蛋白对甘薯茎线虫的杀虫活性验证  54-56
4 讨论  56-59
  4.1 杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌及其筛选  56-57
  4.2 对YBT-008杀虫晶体蛋白和基因的分析  57
  4.3 Cyt2Ba、Cry11Aa、Cry4Aa和Cry4Ba的表达及杀线虫活性  57-59
5 结论  59-66
参考文献  66-74
致谢  74

杀甘薯茎线虫的苏云金芽胞杆菌筛选及特性研究

内容摘要

全文目录

相似论文