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丝状海洋真菌杀线虫代谢物的性质及发酵条件研究
作 者: 史晓讯
导 师: 孟庆恒
学 校: 天津师范大学
专 业: 植物学
关键词: 渤海丝状真菌 杀线虫活性代谢物 发酵条件优化 菌种鉴定
分类号: S482.51
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
海洋真菌因其种类的多样性和遗传背景的特殊性而具有产生新型生物活性物质的巨大潜力。本文从渤海水域分离得到并证实具有杀线活性的3株丝状真菌MTJ5-3-1、MTJ4-2-1、MTJ5-1-4出发,选择杀线活性最高的MTJ5-3-1为试验菌;利用线虫致死率作为指标,通过发酵条件优化实验对发酵影响较大的pH值、接种量、培养温度、培养时间等培养条件和碳氮源及其含量进行优化,确立了优化培养条件;并对海洋真菌MTJ5-3-1的杀线虫活性代谢物质进行了理化性质分析,研究结果如下:1) MTJ5-3-1、MTJ4-2-1、MTJ5-1-43株海洋真菌的杀线活性测定测定结果显示,MTJ5-3-1菌株杀线活性最高,杀线活性达到A级。2)MTJ5-3-1菌的发酵条件优化通过优化试验,得到改进后培养条件为:去皮马铃薯150g/L煮汁,葡萄糖10g/L,酵母膏1g/L,海水含量600m1/L。接种量2×106的孢子悬液,转速120r/min,初始pH6.5~pH7.0,24~26℃发酵96h。3)MTJ5-3-1菌杀线虫活性代谢产物定性分析MTJ5-3-1菌的10倍浓缩发酵液,超滤去掉6000dalton以上的大分子,采用生物活性跟踪检测的方法,对水饱和乙酸乙酯及水饱和正丁醇萃取后的水相组分,结果显示其杀线虫活性达到97.85%;理化性质分析结果表明,该产物为中性耐热活性物质,进一步的薄层层析、可见-紫外光谱分析、红外检测,以及液相色谱分析结果显示,MTJ5-3-1菌杀线虫活性代谢产物包含4种组分,具有含氮糖类或含氮糖类衍生物的分子特征。4)菌种鉴定通过对MTJ5-3-1菌株经典分类指标的观察鉴定,将其初步鉴定为枝顶孢霉。进一步的分子生物学鉴定结果显示,该菌株ITS序列与Acremonium sp. NJM0672和Acremonium sp. NJM 0567的同源性为100%,形态学鉴定结果与Acremonium sp. NJM 0567一致,可确定为Acremonium sp.。结论:通过研究获得一株能够产生杀线虫活性代谢物的菌株MTJ5-3-1,经鉴定该菌株为枝顶孢霉,其活性代谢物具有含氮糖类或含氮糖类衍生物的分子特征,且具有较好的耐热性和相对宽泛的、与大多土壤环境相符的pH适应范围。此外,枝顶孢霉在线虫防治领域还处于探索性研究阶段,同类报道鲜见,为抗线虫海洋真菌的研究提供了新的菌种来源和代谢产物类型,显示出该菌良好的线虫生防制剂开发前景。
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全文目录
摘要 4-5 ABSTRACT 5-9 1 前言 9-16 1.1 植物寄生线虫危害及其微生物防治 9-10 1.1.1 植物线虫的危害 9-10 1.1.2 生物防治在植物线虫防治中的地位 10 1.2 微生物源杀线虫活性物质研究现状 10-13 1.3 海洋真菌杀线虫研究现状 13-14 1.3.1 海洋真菌概述及其生物活性研究 13-14 1.3.2 海洋真菌杀线虫活性代谢产物研究概况 14 1.4 研究目的意义及主要内容 14-16 1.4.1 立题依据及研究意义 14-15 1.4.2 研究内容 15 1.4.3 研究目的 15-16 2 材料与方法 16-28 2.1 实验材料 16-17 2.1.1 菌种 16 2.1.2 供试线虫 16 2.1.3 主要培养基 16-17 2.2 供试试剂与仪器 17-19 2.2.1 实验试剂 17-18 2.2.2 实验仪器 18-19 2.3 实验方法 19-28 2.3.1 菌种活化培养 19 2.3.2 线虫培养 19 2.3.3 发酵液制备 19 2.3.4 杀线虫活性测定 19-20 2.3.5 摇瓶培养条件优化 20 2.3.6 菌种鉴定 20-21 2.3.7 发酵液理化性质分析 21 2.3.8 杀线虫活性组分的性质鉴定 21-26 2.3.9 杀线虫活性代谢产物定性检测 26-28 3 结果与讨论 28-56 3.1 杀线活性菌株筛选 28 3.2 杀线活性代谢物产生条件优化 28-43 3.2.1 不同培养基的筛选 28-29 3.2.2 培养基不同营养因素筛选 29-34 3.2.3 摇瓶发酵条件优化 34-43 3.3 发酵滤液理化性质分析及生物活性检测 43-44 3.3.1 杀线活性物质的热稳定性 43 3.3.2 pH变化对杀线活性物质的影响 43-44 3.3.3 有机溶剂溶解性及其活性 44 3.4 杀线虫活性组分的分析 44-50 3.4.1 发酵液制备与浓缩 44-45 3.4.2 超滤分级 45-46 3.4.3 萃取分离 46-47 3.4.4 D315阴离子交换树脂除酸 47 3.4.5 AB-8大孔吸附树脂分级 47-48 3.4.6 微晶纤维素薄层层析 48-49 3.4.7 高效液相色谱法纯度检测 49-50 3.5 杀线虫活性组分定性检测 50-52 3.5.1 紫外-可见全波长扫描 50-51 3.5.2 红外光谱IR测定 51-52 3.5.3 茚三酮、a-萘酚及a-苯胺-邻苯二钾酸检测 52 3.6 菌种鉴定 52-56 3.6.1 形态学鉴定结果 52-54 3.6.2 分子生物学鉴定结果 54-56 4 全文小结与展望 56-59 4.1 全文小结 56-57 4.2 展望 57-59 参考文献 59-68 附录 68-69 致谢 69
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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治(化学防治) > 各种农药 > 杀螨剂、杀鼠剂、杀其他生物剂 > 杀线虫剂
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