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甘薯茎线虫致病生化物质的初步研究

作　者: 宫卫波
导　师: 蒋继志
学　校: 河北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 甘薯茎线虫致病温度 pH值离子
分类号: S435.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

甘薯茎线虫病(Ditylerechus destructor Thorne)是我国北方甘薯产区的重要病害,一般引起减产10%-30%,重则达50%-60%,甚至绝收。病害发生时茎蔓矮小,甘薯块根糠腐,严重时可造成甘薯整株死亡。目前对该病的研究主要集中于在化学防治和生物防治方面,而对甘薯茎线虫致病物质的研究不多。为深入了解甘薯茎线虫的致病机理,本文对甘薯茎线虫的分离培养条件、以及致病生化物质做了初步研究,为该病的有效防治提供理论依据。从河北赞皇、高邑、丘县、卢龙、保定市市场、河南鹤壁、平顶山、许昌以及山东临沂等地,以五点式(小地块)或“Z”字(大地块)式采集发生甘薯茎线虫病的甘薯块根和土样,采用贝尔曼漏斗法并结合浅盘法以及离心法,分离病薯及土样中的线虫,得到的线虫在35%蔗糖浓度溶液中下离心(2,500rpm,5min),纯化分离线虫,收集率达到了90%以上。采用甘薯末、甘薯培养基、甘薯块根、马铃薯块茎、甘薯和马铃薯的愈伤组织、灰葡萄孢菌分别培养线虫,经比较得知,甘薯末和甘薯培养基培养线虫易发生腐烂导致分离线虫困难,马铃薯块茎切片和甘薯块根切片培养时间较长,愈伤组织培养线虫费时费力,而灰葡萄孢菌培养线虫效果最好。通过对采集、分离和培养的线虫进行形态学和致病性鉴定,确定所采集的线虫为甘薯茎线虫。甘薯茎线虫对供试的甘薯块根切片和甘薯幼苗均具有很强的致病作用,接种后甘薯块根切片失水,颜色变黄,无腐臭气味,最后糠腐；甘薯苗生长缓慢,植株矮小。本实验采用1%(w/V)的5-甲氧基-N,N-2甲基色胺、5%(V/V)的二甲基亚砜刺激线虫分泌物质的产生和分泌,利用TCA/丙酮法和硫酸铵法制备了甘薯茎线虫的分泌物质,经致病性检测发现致病物质主要存在于上述两种方法所得的沉淀中,而上清液中基本无致病物质存在,初步明确致病物质为蛋白类物质；还发现以硫酸铵沉淀法获得的蛋白类物质的致病性较强,而以TCA/丙酮法提取的蛋白类物质的致病性较弱。进一步研究了pH值、紫外线、温度、以及几种离子对蛋白类致病物质(浓度为80μg/mL,用量200μL)致病活性的影响。结果表明,pH值为6.2-6.6时致病性最强,pH值升高或者降低时致病性均明显降低；环境温度为20℃-45℃时,蛋白类物质对甘薯片具有较强的致病性,以30℃时致病性最强；此外,蛋白质类物质经50℃、70℃、90℃、100℃和121℃处理30min后,随处理温度升高,致病性逐渐降低,经50℃水浴处理30min后仍有较强的致病性,在第3d时开始发生病变,第6天时有腐烂或糠腐症状出现,70℃处理后致病性已明显下降,而经100℃处理后的样品对甘薯切片已完全丧失致病性,表明该蛋白类物质不耐高温。经紫外线强度40W、距离50cm照射照射不同时间后,其致病作用随紫外线照射时间延长而减弱,在照射10min后,致病作用已明显减弱,照射60min后,几乎完全丧失了致病作用,表明线虫分泌的蛋白类物质不耐紫外线照射。蛋白类物质中加入一定浓度的硫酸锌、硫酸铜和硝酸镁后,对该物质的致病活性有明显影响,其中在200μL(浓度为80μg/mL)的致病物质中加入0.0025mol/L硫酸锌或硫酸铜后,其致病作用得到增强,加入0.0025-0.05mol/L硝酸镁后致病作用最强,离子浓度升高或降低时致病性均降低。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章综述部分  12-24
  1.1 甘薯的价值  12
  1.2 甘薯茎线虫及其危害  12-13
  1.3 茎线虫的分类  13-14
  1.4 茎线虫的培养  14
  1.5 线虫的分泌物  14-19
    1.5.1 蛋白质类物质  15-18
    1.5.2 非蛋白类物质  18-19
  1.6 植物对线虫的抗性  19-21
    1.6.1 结构抗性  19
    1.6.2 抗线虫基因  19-21
  1.7 茎线虫的防治  21-23
    1.7.1 化学防治  21-22
    1.7.2 生物防治  22
    1.7.3 物理防治  22
    1.7.4 遗传育种  22-23
    1.7.5 检疫检验  23
  1.8 本研究的目的和意义  23-24
第二章甘薯茎线虫的采集分离与培养鉴定  24-37
  2.1 实验材料  24-25
    2.1.1 材料及菌种  24
    2.1.2 试剂  24-25
    2.1.3 仪器设备  25
  2.2 实验方法  25-29
    2.2.1 甘薯茎线虫的采集  25-26
    2.2.2 甘薯茎线虫的分离和浓缩  26-27
    2.2.3 甘薯茎线虫的消毒  27
    2.2.4 甘薯茎线虫的培养  27-28
    2.2.5 甘薯茎线虫的鉴定  28-29
  2.3 实验结果  29-35
    2.3.1 甘薯茎线虫的采集  29
    2.3.2 线虫的分离  29-30
    2.3.3 甘薯茎线虫的消毒  30
    2.3.4 甘薯茎线虫的培养  30-31
    2.3.5 线虫的鉴定  31-35
  2.4 讨论  35-37
第三章甘薯茎线虫的致病生化物质分析  37-45
  3.1 实验材料  37-38
    3.1.1 材料  37
    3.1.2 试剂及仪器  37-38
  3.2 实验步骤  38-40
    3.2.1 线虫致病物质的制备  38
    3.2.2 线虫分泌物及其蛋白质的致病性检测  38-39
    3.2.3 致病蛋白致病最适环境温度  39
    3.2.4 温度处理对致病蛋白活性的影响  39
    3.2.5 紫外线处理对致病蛋白活性的影响  39
    3.2.6 pH值对致病蛋白活性的影响  39
    3.2.7 不同无机离子对致病蛋白活性的影响  39-40
  3.3 结果与分析  40-43
    3.3.1 线虫分泌物的致病性  40
    3.3.2 线虫分泌物中蛋白类物质的致病活性  40-41
    3.3.3 致病蛋白致病最适环境温度  41
    3.3.4 温度处理对致病蛋白活性的影响  41
    3.3.5 不同紫外线处理对致病蛋白活性的影响  41-42
    3.3.6 pH值对致病物质的影响  42
    3.3.7 盐浓度对致病物质活性影响  42-43
  3.4 讨论  43-45
结论  45-46
参考文献  46-52
致谢  52-53
附录  53

甘薯茎线虫致病生化物质的初步研究

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