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甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究

作　者: 许科慧
导　师: 庞海
学　校: 清华大学
专　业: 药理学
关键词: 甲型流感病毒 M2 广谱疫苗 多克隆抗血清 单克隆抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


流感病毒可在短期内致病并迅速蔓延,其中甲型流感病毒的流行性最强,几乎每年都会在世界范围内引发不同程度的流行,危及人类健康并且造成严重的经济损失。如今大多数甲型流感疫苗为病毒裂解疫苗、灭活疫苗或针对病毒表面抗原HA和NA的重组疫苗,但是由于表面抗原HA和NA变异很大,这些疫苗在不同亚型间的交叉保护作用受到很大的局限。M2蛋白是流感病毒颗粒表面的第三种抗原蛋白,在所有已知的不同亚型的甲型流感病毒中高度保守,自1918年流感大流行以来几乎未发生变化。因此,M2蛋白成为了一个甲型流感广谱疫苗的理想候选抗原。M2蛋白在病毒颗粒包膜上呈低密度表达,灭活病毒疫苗很难诱导出M2特异性抗体,因此低成本的原核表达系统成为获得大量抗原的有效途径。但是,M2重组蛋白的疏水性强,在原核系统中难以获得大量的表达。我们在尝试原核表达M2蛋白的过程中,意外地获得M2蛋白突变体,在C端一段的短肽,使其在E.coli中具有很高的表达量。我们将其重新改造构建后命名为M2MH,经过摸索和优化纯化条件,得到了大量较高纯度的重组蛋白M2MH,质谱和电镜结果表明M2MH形成了多聚体,提示其作为抗原,具备很好的免疫原性。用纯化的重组蛋白M2MH免疫BALB/C小鼠后,在小鼠体内诱导出高滴度的M2特异性多克隆抗血清,不仅能够识别真核细胞表面表达的重组蛋白M2,还能够识别甲型流感不同亚型的病毒表面抗原蛋白M2,以及被流感病毒侵染的MDCK细胞表面表达的天然蛋白M2,说明M2MH虽有突变多肽,却保有了很强的免疫原性。致死量的甲型流感病毒对免疫后的小鼠滴鼻攻击,从小鼠的体重变化、生存率变化、肺组织病变程度几个方面评估重组蛋白的免疫保护作用。结果表明重组蛋白能够在动物体内诱导出一定的免疫反应,使小鼠有效抵抗病毒的攻击,该实验结果为进一步利用M2MH作为抗原研制广谱疫苗提供了依据。另外,我们运用杂交瘤技术,成功筛选出28株稳定分泌M2蛋白特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为甲型流感病毒感染的诊断、治疗及病毒致病机制研究奠定了基础。

全文目录


摘要  2-3Abstract  3-7第1章 引言  7-14  1.1 甲型流感病毒与禽流感  7-8  1.2 甲型流感病毒M2 蛋白的国内外研究进展  8-11    1.2.1 M2 蛋白基因及分子结构特征  8-9    1.2.2 M2 蛋白在病毒复制中具有重要作用  9-11  1.3 M2 蛋白是重要的病毒抗原，在疫苗发展中具有重要意义  11-13    1.3.1 病毒变异和免疫逃逸  11    1.3.2 基于流感病毒M2 蛋白研制广谱流感疫苗  11-13  1.4 本课题研究的意义与研究内容  13  1.5 论文各部分主要内容  13-14第2章 甲型流感病毒M2 蛋白的生物信息学分析  14-19  2.1 引言  14  2.2 方法  14-15    2.2.1 理化性质分析  14    2.2.2 信号肽预测  14-15    2.2.3 膜蛋白跨膜区预测  15    2.2.4 同源性分析  15  2.3 M2 生物信息学分析结果  15-17  2.4 本章小结  17-19第3章 甲型流感病毒M2 蛋白的原核表达、纯化  19-31  3.1 引言  19-21    3.1.1 膜蛋白的体外表达  19    3.1.2 膜蛋白的分离纯化  19-21  3.2 实验材料  21-22  3.3 实验方法  22-27    3.3.1 载体的构建和原核表达  22-24    3.3.2 M2MH 融合蛋白的纯化  24-25    3.3.3 质谱分析  25-26    3.3.4 蛋白质印迹  26-27  3.4 实验结果  27-29    3.4.1 M2MH 重组质粒的构建与鉴定  27    3.4.2 M2MH 重组质粒的原核表达与亲和层析纯化  27-29  3.5 本章小结  29-31第4章 M2MH 蛋白多克隆抗血清的制备与鉴定  31-45  4.1 引言  31-32    4.1.1 多克隆抗血清  31    4.1.2 重组蛋白的真核表达  31-32    4.1.3 M2 特异性抗体的抗病毒原理  32  4.2 实验材料  32-33    4.2.1 质粒及细胞株  32    4.2.2 试剂  32-33    4.2.3 实验动物  33  4.3 实验方法  33-38    4.3.1 真核表达质粒的构建及瞬时转染  33-35    4.3.2 真核表达质粒的瞬时转染  35    4.3.3 多克隆抗血清的制备  35-36    4.3.4 多克隆抗血清的鉴定  36-37    4.3.5 体内攻毒实验  37-38  4.4 实验结果  38-44    4.4.1 真核表达重组质粒的构建与鉴定  38-39    4.4.2 多抗血清的鉴定  39-42    4.4.3 体内攻毒试验  42-44  4.5 本章小结  44-45第5章 M2MH 蛋白单克隆抗体的制备与鉴定  45-50  5.1 引言  45-46    5.1.1 单克隆抗体与杂交瘤技术  45    5.1.2 M2 的单克隆抗体  45-46  5.2 实验材料  46-47    5.2.1 细胞  46    5.2.2 试剂  46-47  5.3 实验方法  47-48    5.3.1 动物免疫  47    5.3.2 细胞融合  47    5.3.3 杂交瘤细胞的筛选  47-48    5.3.4 有限稀释法克隆化杂交瘤细胞  48    5.3.5 腹水的制备与鉴定  48  5.4 实验结果  48-49  5.5 本章小结  49-50第6章 结论  50-51参考文献  51-54致谢  54-55个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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