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三个昆虫蛋白基因的分子克隆、表达及功能研究

作　者: 鲁炜
导　师: 崔征；陈炳来
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 生药学
关键词: 昆虫 桑天牛 红光熊蜂 分子克隆 表达 杆状病毒 酶活性
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


分子生物学、基因工程技术等生命科学学科的不断进步,使得药用昆虫的研究得以深入到分子水平。本论文开展了三个昆虫蛋白基因的分子克隆、表达和功能研究。1.桑天牛抗菌肽AgCRP(Apriona gemari Cysteine Rich Protein)基因的分子克隆、表达和功能研究首先,通过桑天牛幼虫的表达序列标签(ESTs)筛选到了目标基因,用RT-PCR技术,成功克隆了AgCRP基因。测序结果表明,AgCRP基因序列全长为207bp,可编码69个氨基酸残基的蛋白。经NCBI数据库检索和氨基酸序列比对分析,AgCRP成熟肽与长角天牛(Acalolepta luxuriosa)抗菌肽AlCRP最为接近,两者同源性达62%;与其他昆虫抗菌肽一样,AgCRP也具有能形成CSαβ模块(Cysteine Stabilizedαβmotif)的“C…CXXXC…C…CXC”保守序列。AgCRP属首次报道的基因序列,已在GenBank登录(登录号:AY771360)。通过Northern blot杂交确定了AgCRP特异表达于桑天牛的脂肪体,并可被伤害、细菌或真菌等刺激上调。证明了AgCRP属于昆虫防御素型抗菌肽。将克隆到的AgCRP基因作EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到pBac-1质粒相应的多克隆位点上,获得重组杆状病毒转移载体pBac-CRP。然后在无血清条件下,以Lipofectin介导bAcGOZA杆状病毒DNA与pBac-CRP共转染草地夜蛾(Sodoptera frugiperda)Sf-9昆虫细胞,细胞呈明显感染形态,这是AgCRP基因首次在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达。2.红光熊蜂(Bombus ignitus)蜂毒蛋白酶(BiVP)和脂酶(BiLP)基因的分子克隆、表达及功能研究首先,通过红光熊蜂的ESTs筛选到了目标基因,用RACE-PCR和RT-PCR技术,分别成功克隆BiVP基因和BiLP基因,测序结果表明,两者的核苷酸序列全长分别1083bp和954bp,可分别编码360个氨基酸残基和317个氨基酸残基的蛋白。推测两个蛋白的分子量分别为39.3kD和34.3kD。经NCBI数据库检索和氨基酸序列比对分析,BiVP具有极为保守的由His、Asp和Set构成的催化三联体(catalytic triad)活性中心,属于丝氨酸蛋白酶;BiLP具有脂酶蛋白的特征保守序列“GXSXG”,属于脂酶类蛋白;两者均属首次报道的基因序列,其中BiLP基因已在GenBank登录(登录号:EU443786)。通过Northern blot杂交对BiVP和BiLP基因的特异性表达进行了考察。两者均特异表达于红光熊蜂的脂肪体。将克隆到的BiVP和BiLP基因作XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后连接到pBac-1质粒相应的多克隆位点上,获得重组杆状病毒转移载体pBac1-BiVP和pBac1-BiLP。然后在无血清条件下,以Lipofectin介导与bAcGOZA杆状病毒DNA共转染草地夜蛾Sf-9昆虫细胞,细胞呈明显感染形态,这是BiVP和BiLP基因首次在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达。以快速蛋白液相色谱法纯化了重组BiVP蛋白,纯化程度约51倍,收率达到了57.8%。在酶活性研究中,发现重组BiVP蛋白的酶活性最适pH值为pH3.0,并在pH2.0～5.0的范围内能够保持活性的稳定。在pH3.0时,其最适温度为45℃,并且能在该温度下保持活性稳定至少10min。本研究实现了对BiVP重组蛋白酶活性的首次检测。

全文目录


中文摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
ABBREVIATIONS  14-15
前言  15-19
  1.药用昆虫研究的重要意义  15-16
  2.我国药用昆虫研究现状  16-17
  3.选择红光熊蜂和桑天牛作为研究对象的立题依据  17-18
  4.本课题研究的设计思想  18-19
研究室常用实验方法  19-32
第一部分 桑天牛抗菌肽(AgCRP)的分子克隆、表达及功能研究  32-55
  第一章 昆虫抗菌肽的研究概况  33-41
    1.1 昆虫抗菌肽的种类与结构特点  33-36
    1.2 昆虫抗菌肽的作用机理  36-38
    1.3 昆虫抗菌肽的生物学活性及构效关系研究  38-40
    1.4 鞘翅目昆虫抗菌肽的研究  40-41
  第二章 桑天牛抗菌肽(AgCRP)的基因克隆、表达和功能研究  41-55
    2.1 实验材料和实验方法  41-45
    2.2 实验结果与分析  45-53
    2.3 讨论  53-55
第二部分 红光熊蜂(Bombus ignitus)蜂毒蛋白酶(BiVP)和脂酶(BiLP)基因的分子克隆、表达及功能研究  55-100
  第三章 蜂毒的研究与开发利用进展  56-67
    3.1 蜂毒的来源  56
    3.2 蜂毒的理化特性和成分  56-61
    3.3 蜂毒的应用  61-64
    3.4 蜂毒的分子生物学研究  64-66
    3.5 小结  66-67
  第四章 红光熊蜂蜂毒蛋白酶BiVP的基因克隆、表达及功能研究  67-86
    4.1 实验材料和实验方法  67-71
    4.2 实验结果与分析  71-85
    4.3 讨论  85-86
  第五章 红光熊蜂脂酶BiLP的基因克隆、表达及功能研究  86-100
    5.1 实验材料和实验方法  86-89
    5.2 实验结果与分析  89-99
    5.3 讨论  99-100
结论  100-102
参考文献  102-111
致谢  111-112
发表文章  112

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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