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水稻（Oryza sativa L.）RSG6基因及其启动子的表达研究

作　者: 兰利琼
导　师: 陈放
学　校: 四川大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻(Oryza sativa L.) 精细胞 RSG6基因 RNA原位杂交 免疫定位 启动子 缺失片段 瞬时表达 稳定表达 转基因烟草 反义表达 正义表达载体 愈伤组织
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


RSG6是以从水稻(Oryza sativa L.)精细胞与二细胞花粉的差减文库中获得的在精细胞中优势表达的克隆作为探针，筛选水稻精细胞cDNA文库而得到的基因，它与已知基因没有明显的同源性，为新发现基因。我们对该基因进行生物信息学分析，发现RSG6在水稻第8、10号染色体上各有一个完整的拷贝，其同源性片段也出现在第4、12号染色体上。 用地高辛RNA标记试剂盒，采用体外转录方法标记RSG6基因的cDNA序列中长度为258bp的一段作为反义RNA探针，运用RNA原位杂交技术，探讨了RSG6基因的mRNA在水稻根、茎、叶以及花药发育各阶段组织中的分布情况。结果显示，在营养器官和发育早期的花药——花粉母细胞中均未能检测到杂交信号；RSG6基因的活化开始发生于单细胞后期，在花粉成熟过程中，RSG6基因的转录水平逐渐增强，当进入花粉成熟期时，花粉中两个精细胞所含有的RSG6基因的mRNA量达到最高水平。说明RSG6基因主要在水稻精细胞中进行转录，其转录具有明显的时空差异性。对已经从家兔体内获得的抗RSG6蛋白的抗血清进行纯化，将纯化后的多克隆抗体用于水稻各组织器官和雄配子体发育各阶段中RSG6基因表达蛋白的Western-blot分析和免疫定位研究。结果表明，RSG6基因主要在雄配子体发育的后期、尤其是精细胞中表达，是水稻精细胞中的优势表达基因。这一研究结果，与利用原位杂交技术所进行的RSG6的转录时空性研究结果吻合。从分离的精细胞上RSG6蛋白的免疫定位结果来看，RSG6的表达产物主要分布在精细胞的外围，很可能是在细胞膜上，这暗示RSG6基因及其表达产物可能在水稻精细胞的活动——受精作用的信号传导、识别中四川大学博士学位论文发挥作用。 以尺多G‘基因的cDNA中的一段与PBI221中的Cal“v35s启动子连接，转入植物表达载体pB取19中构建反义表达载体pB创19一an以及带有报告基因的PB顶19一an-GUs，转化农杆菌侧，勺西“招对um枷动淤招璐)EHA105后，感染水稻愈伤组织，获得了抗性愈伤组织，其得率分别是27%和21%，转PBm19一an-GUs的抗性愈伤组织经GUS基因片段的PcR检测，阳性率为42.86%。另一方面，将尺义子‘基因全长读码框与表达载体PBllZI连接构建了重组质粒PBllZI.侧沼‘，转化农杆菌，获得了能够使天国G‘基因在其它植物中表达的农杆菌工程菌株，为进一步探讨尺SG石基因的功能打下了基础。 利用已知的尺多G石基因序列和GenBank中提供的尺了G石前导序列设计引物，通过基因组DNA的PCR扩增得到尺乡G石基因的上游片段，分析显示其序列中含有大量的启动子元件。通过设计带有酶切位点的引物扩增出缺失片段PSI、PsZ、PBI、PBZ，利用质粒PBI221中的Gus基因作为报告基因，最后与植物表达载体pB取19连接构建出重组质粒pBIN19一GU万51、pBIN19一G。万52、PBIN19一G之乃旧1、PBIN19一G之巧旧2以及阳性对照PB创19一GUs，利用农杆菌EHA105转化烟草伽‘。才钻阴以故西口翻脚L)和水稻。通过在烟草叶片、成熟花粉和水稻愈伤组织中的瞬时表达，证实这四个缺失片段都具有启动子功能。而且，这四个片段虽然不具有种属特异性和组织特异性，但表现出启动效率上的组织差异性，推测凡9多石基因在不同组织和雄配子发育的不同阶段中表达的差异性很可能就主要是源于其启动子功能的组织差异性。在烟草的稳定转化中，5种重组质粒分别以44.98%、36.94%、42.13%、30.26%和34.26%的比例获得转基因幼苗。为进一步定量地研究尺.义子石基因上游序列的启动子功能奠定了基础。

全文目录


图片目录  8-10
表格目录  10-11
中文摘要  11-13
英文摘要  13-16
A卷 水稻RSG6基因生物信息学的初步分析  16-30
  1 RSG6基因cDNA及推测蛋白全序列  17-18
  2 RSG6基因cDNA序列分析  18-21
    2.1 酶切位点分析  18-19
    2.2 同源性及基因定位分析  19-21
  3 RSG6基因推测蛋白序列分析  21-26
    3.1 疏水性分析  21-22
    3.2 跨膜区分析  22-23
    3.3 同源性分析  23-24
    3.4 motif数据库分析  24-25
    3.5 结构功能域分析  25
    3.6 二级结构预测  25-26
  4 结论  26-28
  参考文献  28-30
B卷 水稻RSG6基因及其启动子的表达研究  30-137
  第一部分 RSG6基因表达的时空性研究  30-65
    第一章 水稻RSG6基因转录的时空性研究  31-48
      摘要  31
      1 引言  31-33
      2 材料和方法  33-38
        2.1 材料  33-34
        2.2 方法  34-38
      3 结果  38-41
        3.1 RNA探针模板DNA片段的制备  38-39
        3.2 重组质粒pSPT18-RSG6F的构建与酶切鉴定  39-40
        3.3 重组质粒pSPT18-RSG6F线性化  40
        3.4 RNA探针的检测  40-41
        3.5 原位杂交显示RSG6基因在水稻花粉发育中的时空表达  41
      4 讨论  41-45
      小结  45-46
      参考文献  46-48
    第二章 RSG6基因蛋白表达的时空性研究  48-65
      摘要  48
      1 引言  48-50
      2 材料和方法  50-54
        2.1 材料  50
        2.2 方法  50-54
      3 结果  54-60
        3.1 抗体的纯化  54
        3.2 Western-blot分析在水稻成熟花粉和精细胞中检测到RSG6蛋白的表达  54-56
        3.3 RSG6蛋白的组织化学定位  56
        3.4 RSG6蛋白的免疫荧光定位  56-60
      4 讨论  60-61
      小结  61-62
      参考文献  62-65
  第二部分 RSG6基因的正义与反义表达  65-90
    第三章 水稻反义表达体系的建立  66-83
      摘要  66
      1 引言  66-67
      2 材料和方法  67-72
        2.1 材料  67-68
        2.2 方法  68-72
      3 结果和分析  72-80
        3.1 反义表达载体的构建  72-78
        3.2 利用农杆菌对水稻愈伤组织的转化  78-80
      小结  80
      参考文献  80-83
    第四章 正义表达载体的构建  83-90
      摘要  83
      1 引言  83
      2 材料和方法  83-86
        2.1 材料  83-84
        2.2 方法  84-86
      3 结果和分析  86-88
        3.1 RSG6读码框的PCR扩增和检测  86-87
        3.2 表达载体的构建及农杆菌的转化  87-88
      小结  88-89
      参考文献  89-90
  第三部分 RSG6基因启动子的克隆及功能研究  90-137
    第五章 水稻RSG6基因启动子的克隆及缺失片段表达载体构建  91-111
      摘要  91
      1 引言  91-92
      2 材料和方法  92-97
        2.1 材料  92-93
        2.2 方法  93-97
      3 结果  97-106
        3.1 RSG6基因启动子的扩增  97-98
        3.2 启动子序列分析  98-103
        3.3 表达载体的构建  103-106
      4 讨论  106-109
      小结  109
      参考文献  109-111
    第六章 RSG6基因启动子的功能研究  111-137
      摘要  111
      1 引言  111-112
      2 材料和方法  112-117
        2.1 材料  112-114
        2.2 方法  114-117
      3 结果  117-131
        3.1 多种植物成熟花粉GUS本底调查  117
        3.2 GUS基因在烟草中的瞬时表达  117-125
        3.3 GUS基因在水稻愈伤组织中的瞬时表达  125-126
        3.4 GUS基因在烟草中的稳定表达  126-130
        3.5 GUS基因在水稻中的稳定表达  130-131
      4 讨论  131-134
        4.1 多种植物成熟花粉具有内源GUS  131-132
        4.2 根癌农杆菌Ti质粒介导的外源基因对烟草的转化  132
        4.3 缺失片段的启动子功能分析  132-134
      小结  134-135
      参考文献  135-137
C卷 文献综述  137-160
  被子植物生殖发育研究进展  138-160
    一. 被子植物双受精  138-139
    二. 植物的雄性生殖单位(MGU)  139-140
    三. 植物生殖细胞的分离和体外受精  140-141
    四. 植物生殖发育的研究  141-144
    五. 植物启动子进展  144-151
      1 植物启动子的结构特征  145-146
      2 植物发育中特异表达启动子  146-148
      3 植物生殖发育特异启动子  148-151
    参考文献  151-160
致谢  160-161
在读期间发表及待发表论文情况  161-163
声明  163

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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