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不同培养方法和细胞因子对小鼠生精细胞的增殖分化效应

作　者: 孙静波
导　师: 姜宏
学　校: 安徽医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 生精细胞细胞因子体外培养 RT-PCR 流式细胞术
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:比较曲细精管片段培养和混合细胞共培养两种不同方法对小鼠生精细胞的增殖分化效应,旨在建立一个高效、稳定的小鼠生精细胞体外培养方法,获得更多接近成熟的单倍体精子细胞。方法:对7~8天龄小鼠生精细胞分别进行曲细精管片段培养和混合细胞共培养,通过细胞形态学观察、存活率和粗线期精母细胞特异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析,比较两种培养方法生精细胞的存活、增殖以及分化情况。结果:曲细精管片段培养法第10~12天可见到圆形精子细胞,13~14天出现少量带鞭毛的精子细胞或长形精子,第10天可检测出单倍体峰和单倍体精子细胞特异性基因TP1表达;混合细胞培养法5~7天可见圆形精子细胞,第5天即可检测出单倍体峰和单倍体精子细胞特异性基因TP1表达,8~10天少量精子细胞长出鞭毛或胞体渐变成长形。混合细胞培养法所获细胞数、存活率及单倍体精子细胞分化率均显著高于曲细精管片段培养法(P<0.05)。培养过程中,各级生精细胞随培养时间延长,存活率逐渐降低,细胞数减少,曲细精管片段培养和混合细胞培养分别在第3周和第4周出现大部分生精细胞和支持细胞脱落死亡。结论:曲细精管片段培养和生精细胞-支持细胞共培养均可获得单倍体精子细胞,较之曲细精管片段培养法,混合细胞共培养法存活率更高,可更早获得更多单倍体精子细胞。目的:通过在生精细胞体外培养过程中添加不同浓度表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和干细胞因子(stem cell factor,SCF),探讨两种细胞因子对生精细胞增殖、分化的最佳作用浓度以及它们之间的最佳组合浓度。方法:对7~8天龄小鼠生精细胞进行混合细胞体外培养,在培养基中分别添加不同浓度的EGF和SCF(分别为5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、100 ng/ml),并进行EGF和SCF的交互实验,通过细胞形态学观察、存活率和粗线期精母细胞特异性基因P19、单倍体精子细胞特异性基因TP1检测及染色体倍性分析,探讨EGF和SCF对生精细胞的体外增殖分化效应。结果:加入EGF或SCF2-4天,各浓度组中可见不同程度增殖呈团或链状的细胞团紧密连接,以EGF 20ng/ml组和SCF 40ng/ml组较为明显,第5-7天出现圆形精子细胞,8-10天少部分精子细胞长出鞭毛或渐变成长形精子细胞,第4周出现大部分生精细胞和支持细胞脱落死亡。培养第7天,EGF浓度为20ng/ml、SCF浓度为40ng/ml时生精细胞数和存活率显著高于与其它各浓度组(P<0.05),且浓度为40ng/ml的SCF可显著提高单倍体峰并降低P19/TP1比值(P<0.05)。EGF与SCF配伍时,EGF浓度为12 ng/ml时生精细胞增殖率最高,而SCF的作用效果呈线性递增趋势。结论:在混合生精细胞体外培养体系中,添加一定浓度的EGF和SCF可显著提高生精细胞数和存活率,而且SCF可提高体单倍体精子的形成率,两者交互实验时,对细胞增殖有相互叠加效应。

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英文缩略词表 5-6中文摘要 6-8Abstract 8-121 引言 12-142 第一部分 14-30 2.1 材料 14-16 2.2 方法 16-21 2.3 统计学分析 21 2.4 结果 21-27 2.5 讨论 27-29 2.6 结论 29-303 第二部分 30-50 3.1 材料 30-32 3.2 方法 32-37 3.3 统计学分析 37 3.4 结果 37-42 3.5 讨论 42-43 3.6 结论 43-45 3.7 参考文献 45-50附录 50-51致谢 51-53综述 53-63 参考文献 60-63

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