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转小麦类蛋白激酶基因TA50-10烟草及其抗病性分析

作　者: 杜秀贞
导　师: 宋从凤
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: TA50-10基因 蛋白激酶 转基因烟草 抗病性
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


TA50-10是本实验室前期研究中从小麦cDNA上扩增获得的基因片断,它编码的多肽含有类蛋白激酶(Protein Kinase like)催化域。大肠杆菌原核表达的该基因的粗蛋白喷雾烟草叶片具有系统诱导烟草抗烟草花叶病毒(TMV)的作用。为了深入研究TA50-10的诱导抗病性及其机理,将TA50-10基因片段用BamH I和XbaⅠ双酶切后回收,连接到用这两个酶切过的转基因表达载体pBI121上,构建成重组植物表达载体pB-50-10。重组载体转化至大肠杆菌Top10中,质粒经测序验证正确后,通过冻融法转化农杆菌EHA105。经菌落PCR验证后,挑选阳性克隆供转化烟草使用。采用叶盘法将pB-50-10转化野生型烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选得到43株T0代再生植株,PCR检测发现有38株为阳性株系。GUS组织活性分析发现TA50-10在转基因植株中有所表达,但在不同植株中的根茎叶部位的表达水平有差异。RT-PCR检测发现TA50-10能够在转录水平上表达。抗病性鉴定结果表明,转TA50-10基因的烟草对烟草花叶病毒(TMV)有较好的抗性。ELISA检测接种烟草叶片中TMV的含量表明,TA50-10基因的表达可以抑制TMV在烟草组织内的增殖。转基因烟草接种TMV后的过氧化物酶(Peroxidase, POD)和(Polyphenoloxidase, PPO)酶活性均高于野生型烟草。转基因烟草还具有抗软腐病菌Pectobactrium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc)及青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)的能力。TA50-10来自于可食用的农作物小麦,安全无毒,转基因后能够诱导包括抗病毒和细菌在内的抗病性,将之应用于烟草NC89的抗性育种,具有良好的应用前景。

全文目录


摘要  8-9ABSTRACT  9-10上篇 文献综述  10-22  第一章 植物抗病基因工程研究进展  10-18    1 植物抗病基因工程的原理及研究现状  10-11      1.1 植物抗病基因工程的原理  10-11      1.2 植物抗病基因工程的研究现状  11    2 用于植物抗病基因工程的目的基因  11-14      2.1 植物抗病基因(R基因)  11-12      2.2 病原体无毒基因(avr基因)  12      2.3 植物的防卫反应基因  12-14        2.3.1 病程相关蛋白基因  13        2.3.2 抗菌蛋白基因  13        2.3.3 溶菌酶基因  13-14    3 植物遗传转化方法  14-15      3.1 根癌土壤杆菌介导的转化法  14      3.2 基因枪法  14-15    4 转基因植物的安全性评价  15-16      4.1 转基因植物的环境安全性  15      4.2 转基因植物的食品安全性  15-16    5 展望  16-18  第二章 植物蛋白激酶研究进展  18-22    1 植物蛋白激酶的研究现状  18-19    2 植物蛋白激酶的分类及功能  19-20    3 展望  20-21    本课题的研究目的和意义  21-22下篇 研究内容  22-64  第一章 植物转基因重组载体的构建  22-34    1 材料和方法  22-30      1.1 材料  22-23        1.1.1 菌株和质粒  22        1.1.2 试剂  22        1.1.3 培养基  22-23      1.2 方法  23-29        1.2.1 引物设计  23        1.2.2 PCR扩增  23-24        1.2.3 琼脂糖凝胶电泳分析  24        1.2.4 胶回收  24-25        1.2.5 将目的基因连接到pMD18-T载体上  25-26        1.2.6 大肠杆菌感受态的制备  26-27        1.2.7 连接产物的转化及转化子的菌落PCR验证  27        1.2.8 质粒提取  27-28        1.2.9 酶切验证  28-29      1.3 重组质粒导入土壤杆菌  29-30        1.3.1 土壤杆菌感受态细胞的制备  29        1.3.2 土壤杆菌感受态细胞的转化  29        1.3.3 转化子的鉴定  29-30    2 结果和分析  30-31      2.1 目的基因片段的T-载体克隆  30      2.2 重组植物表达载体的构建  30-31    3 讨论  31-34  第二章 转基因烟草的产生和鉴定  34-44    1 材料和方法  34-39      1.1 材料  34-35        1.1.1 植物和微生物材料  34        1.1.2 抗生素和生长素  34        1.1.3 试剂  34-35        1.1.4 培养基  35      1.2 方法  35-39        1.2.1 转基因烟草的产生  35-36        1.2.2 转基因烟草的PCR检测  36-37        1.2.3 转基因烟草的GUS染色分析  37        1.2.4 转基因烟草的RT-PCR检测  37-39    2 结果与分析  39-41      2.1 转基因烟草的产生  39      2.2 转基因烟草的PCR检测  39-40      2.3 转基因烟草的GUS染色分析  40-41      2.4 转基因烟草的RT-PCR检测  41    3 讨论  41-44  第三章 转基因烟草的T_1代种子筛选及遗传分析  44-48    1 材料与方法  44-45      1.1 材料  44        1.1.1 植物材料  44        1.1.2 试剂  44        1.1.3 培养基  44      1.2 方法  44-45        1.2.1 T_1代种子的筛选  44-45        1.2.2 T_1代种子的遗传分析  45    2 结果与分析  45-47      2.1 T_1代种子的筛选  45-46      2.2 T_1代种子的遗传分析  46-47    3 讨论  47-48  第四章 转基因烟草的抗病性测定  48-60    1 材料与方法  48-52      1.1 材料  48-49        1.1.1 植物材料  48        1.1.2 菌株  48        1.1.3 主要试剂  48        1.1.4 培养基  48-49      1.2 方法  49-52        1.2.1 转基因烟草抗TMV分析  49-50        1.2.2 ELISA法检测叶片中的TMV含量  50        1.2.3 转基因烟草接种TMV后的酶活性测定  50-51        1.2.4 转基因烟草抗软腐病分析  51-52        1.2.5 转基因烟草抗烟草青枯病分析  52    2 结果与分析  52-57      2.1 转基因烟草抗TMV分析  52-56        2.1.1 ELISA法检测叶片中的TMV含量  54-55        2.1.2 转基因烟草接种TMV后的酶活性测定  55-56      2.2 转基因烟草抗软腐病分析  56      2.3 转基因烟草抗烟草青枯病分析  56-57    3 讨论  57-60  附:小麦中类蛋白激酶基因片段TA50-10的同源性分析  60-64    1 方法  60    2 结果与分析  60-62    3 讨论  62-64全文总结  64-66参考文献  66-74附录一 本文用到的培养基和缓冲液  74-80附录二 缩略语  80-82攻读硕士学位期间发表论文  82-84本论文研究受资助基金  84-86致谢  86

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 烟草（菸草）
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