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荷花液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆及转基因烟草耐盐性的初步分析

作　者: 郭会敏
导　师: 徐迎春；刘兆磊
学　校: 南京农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 荷花 液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因 克隆 荧光定量PCR 转基因 烟草 耐盐性
分类号: S682.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


盐胁迫严重影响植物的生长和发育,而液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白可以将多余的Na+转运并区隔化于液泡中,在植物耐盐性方面起着重要的作用。本研究以‘冬荷’为材料,通过设计简并引物,利用RT-PCR和RACE等技术克隆到了一个液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为NnNHX1。序列分析显示,该基因全长为2237 bp,5’和3’非编码区分别长426bp和194bp,开放阅读框为1617bp。疏水性和跨膜分析显示NnNHX1蛋白的N-端高度疏水并含有11个跨膜区域,C-端是一个亲水的尾巴。对NnNHX1的氨基酸序列进行比对表明,NnNHX1与葡萄、水稻、拟南芥等的液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白同源性较高,并且都具有高度保守的氨氯吡嗪咪结合位点序列LFFIYLLPPI。系统进化树分析表明NnNHX1与液胞膜型Na+/H+逆向转运蛋白关系较近,而与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白关系较远。构建了NnNHX1基因的植物双元表达载体pCAMBIA1301-220-NnNHX1，采用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,经共培养、继代筛选与生根筛选后,共获得14个抗性植株,经PCR检测后,确定其中7株抗性苗为转基因株系,分别命名为T-N1-T-N5、T-N9和T-N10。根据NHX1基因的保守序列和NnNHX1基因的特异序列设计引物进行荧光定量PCR,结果表明转基因株系T-N1、T-N2和T-N10中NnNHx1和总NHXl表达量与对照相比均较高。对转基因烟草组培苗进行盐胁迫表明,当培养基中NaCl浓度为100 mmol/L时,转基因与对照植株均能生根,但转基因植株生长情况好于对照；当NaCl浓度为200mmol/L时,对照植株无法正常生根,叶片与茎都发生黄化,濒临死亡,而转基因植株仍可缓慢生长。对转基因烟草盆栽苗进行盐胁迫并测定相关生理指标,结果表明,正常情况下,对照和转基因株系叶片的各个生理指标大致相同,而经盐胁迫处理后,各植株叶绿素含量都明显降低,但转基因株系下降的幅度小于对照；丙二醛含量和相对电导率均有所上升,且对照植株的值略高于转基因株系；转基因株系和对照植株的Pro含量上升、SOD和POD活性均变高,且与对照相比,转基因株系变化幅度更为明显。统计转基因烟草种子在盐胁迫下的发芽率,表明各转基因株系烟草种子的萌发情况好于对照,耐盐性状能够进行正常遗传。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10缩略词  10-11引言  11-12第一章 文献综述  12-26  1 盐胁迫对植物造成的危害  12-13    1.1 渗透胁迫  13    1.2 离子胁迫  13    1.3 代谢紊乱  13  2 植物的耐盐机制  13-18    2.1 避盐机制  14-15    2.2 渗透调节机制  15-17    2.3 活性氧清除机制  17    2.4 离子平衡机制  17-18  3 Na~+/H~+逆向转运蛋白研究进展  18-26    3.1 质膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白  19-21    3.2 液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白  21-26第二章 荷花液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆与序列分析  26-44  1 材料与方法  26-34    1.1 植物材料  26    1.2 试剂与仪器  26    1.3 实验方法  26-34  2 结果与分析  34-41    2.1 RNA提取质量与反转录效果检测  34-35    2.2 NnNHX1基因的克隆  35-36    2.3 NnNHX1基因的序列分析  36-41  3 讨论  41-44第三章 转荷花NnNHX1基因烟草的耐盐性分析  44-64  1 材料与方法  44-52    1.1 植物材料  44    1.2 试剂与仪器  44    1.3 实验方法  44-52  2 结果与分析  52-60    2.1 荷花NnNHX1基因表达载体的构建  52-54    2.2 转荷花NnNHX1基因烟草苗的获得和鉴定  54-55    2.3 转荷花NnNHX1基因烟草中NHX1基因的表达情况  55    2.4 转荷花NnNHX1基因烟草组培苗的耐盐性检测  55-57    2.5 转荷花NnNHY1基因烟草盆栽苗的耐盐性检测  57-59    2.6 转荷花NnNHX1基因烟草种子的耐盐性分析  59-60  3 讨论  60-64全文结论  64-66创新点  66-68参考文献  68-80附录  80-82攻读学位期间发表的论文  82-84致谢  84

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 观赏园艺（花卉和观赏树木） > 多年生花卉类 > 其他花卉类 > 水生植物
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