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大豆细菌性斑点病原物的分离鉴定及其两个Ⅲ型效应因子的克隆与功能研究

作　者: 张金梅
导　师: 高学文
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆细菌性斑点病丁香假单胞大豆致病变种分离鉴定反向PCR 农杆菌介导瞬时表达免疫抑制因子
分类号: S435.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

大豆细菌性斑点病(Bacterial Blight of Soybean)是一种由丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv. glycinea (Coeper) Young et. al)引起的世界性病害,是造成大豆减产的主要原因。该病于1906年首次在内布拉斯加州发现,并且在大豆主产区引起严重的经济损失。近年来,在我国东北大豆主产区发现一种类似于细菌性斑点病的严重病害,为了揭示引起该病的病原物,本研究从发病严重的黑龙江佳木斯及吉林长春采集病叶进行病原菌的分离鉴定。经过分离纯化得到25株菌株,将这些菌株回接到大豆叶片上,柯赫氏法则验证,表明这些菌株均为引起该病害的病原菌。从中挑选6株来源不同的菌株进行详细的生理生化鉴定及分子生物学鉴定。16SrDNA序列分析表明6株菌株属于假单胞属细菌,进一步的无毒基因avrD序列同源性分析显示这6株菌株均与丁香假单胞大豆致病变种同源性最高。脂肪酸甲酯鉴定结果显示,4株菌株可鉴定到致病变种,而其它2株菌株只能被鉴定到种。综合致病性鉴定、生理生化鉴定及分子鉴定结果,确定黑龙江佳木斯和吉林长春发生的细菌性病害为丁香假单胞大豆致病变种引起的大豆细菌性斑点病。效应分子是病原物与寄主互作的关键因子。致病植物病原细菌通过Ⅲ型泌出系统将大量的效应因子注射进植物细胞来抑制植物先天免疫反应。这些Ⅲ型效应因子通过三个主要策略来改变寄主的免疫应答。第一个策略是直接分裂寄主蛋白或将靶标蛋白泛素化后通过26S蛋白酶体识别和降解；第二个策略是通过生物合成或RNA结合蛋白的ADP核糖化来改变RNA代谢；第三个策略是通过去磷酸化或直接抑制对植物防卫信号转导中激酶活性。为了研究Ⅲ型泌出效应因子在大豆细菌性斑点病菌致病中的作用,利用反向PCR技术,首次从大豆细菌性斑点病菌基因组中克隆得到两个效应分子HopABl和HopAFl.基因的核苷酸序列已经在GenBank上登陆,登陆号分别为JF826562和JF826563。生物信息学分析表明,HopAB1基因全长是1572bp,编码523个氨基酸；HopAFl基因全长是855bp,编码284个氨基酸。HopABl和HopAFl与同源基因的核苷酸序列同源性分别为69%-96%和86%-99%。二级结构均主要由无规则卷曲、α-螺旋及延伸链组成。信号肽预测显示,两个蛋白均没有信号肽。保守功能区预测显示HopAB1在N末端包含一个E3泛素连接酶功能区。将这两个基因克隆到PVX二元表达载体并转化农杆菌,利用农杆菌介导的瞬时侵染技术在本氏烟中过表达,发现两个效应因子均能抑制由鼠凋亡蛋白(Bax)激发的细胞程序性死亡,将烟草疫霉接种在注射区域,发现效应因子能促进烟草疫霉(Phylophthora nicotianae)侵染烟草(Nicotiana benthamiana),因此本克隆得到的两个效应因子是免疫抑制因子,为进一步研究该菌的致病机理奠定基础。

全文目录

摘要 7-9ABSTRACT 9-11第一章大豆细菌性斑点病的研究进展 11-23 1 丁香假单胞大豆致病变种的概况 11-12 1.1 学名 11 1.2 异名 11 1.3 分类地位 11-12 1.4 寄主范围 12 1.5 形态学及生物学特性 12 2 大豆细菌性斑点病的概况 12-14 2.1 大豆细菌性斑点病的分布 12 2.2 大豆细菌性斑点病病害症状 12-13 2.3 大豆细菌性斑点病的田间发生规律 13-14 3 大豆细菌性斑点病原物的鉴定 14-19 3.1 传统的大豆细菌性斑点病检测鉴定方法 14-15 3.2 表型特征鉴定法 15-16 3.3 分子鉴定法 16-19 参考文献 19-23第二章丁香假单胞菌Ⅲ型效应分子研究进展 23-37 1 效应因子与植物的共进化 23-27 1.1 植物免疫系统的两层防卫机制 24-25 1.2 植物先天免疫系统的进化模式 25-27 1.3 植物抗性蛋白能精确识别病原菌中的效应蛋白 27 2 Ⅲ效应因子的生物学特性 27-31 2.1 激发非寄主及抗性植物的过敏反应 28-29 2.2 抑制基于鞭毛活性的免疫作用 29 2.3 抑制不同激发子激发的HR 29-30 2.4 抑制基于细胞壁反应的抗性 30-31 3 总结及展望 31-33 参考文献 33-37第三章东北地区大豆细菌性斑点病的分离和鉴定 37-55 1 材料和方法 37-45 1.1 实验材料 37-38 1.2 大豆细菌性斑点病病原菌的分离 38-39 1.3 病原菌的鉴定 39-45 2 结果和分析 45-50 2.1 病原菌的分离 45-46 2.2 致病性鉴定 46-47 2.3 病原菌的形态观察 47-48 2.4 病原菌的生理生化结果 48-49 2.5 脂肪酸甲酯鉴定 49 2.6 分子鉴定 49-50 3 小结与讨论 50-53 参考文献 53-55第四章丁香假单胞大豆致病变种两个Ⅲ型效应因子的克隆及功能研究 55-81 1 材料与方法 56-64 1.1 供试菌株、质粒及植物的培养条件 56-58 1.2 工具酶、抗生素及试剂 58 1.3 效应因子的生物信息学预测 58 1.4 效应基因的克隆 58-61 1.5 HrpZ与AvrPtoB的克隆 61 1.6 HopAB1及HopAF1基因生物信息学分析 61-62 1.7 表达载体的构建及转化农杆菌 62-63 1.8 效应分子的生物学功能分析 63-64 2 结果与分析 64-74 2.1 P.syringae pv.glycinea可能存在的效应分子的生物信息学预测 64-65 2.2 效应因子的克隆及序列测定 65-66 2.3 生物信息学分析 66-71 2.4 表达载体的构建及转化农杆菌 71-72 2.5 效应分子的生物学功能分析 72-74 3 讨论 74-77 参考文献 77-81附录 81-91致谢 91

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