学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

柑桔绿霉菌CYP51克隆表达及在DMIs类杀真菌剂筛选中的应用

作　者: 赵莉
导　师: 刘德立
学　校: 华中师范大学
专　业: 农药学
关键词: 柑桔绿霉菌 羊毛甾醇14α-去甲基化酶 表达 14α-去甲基化酶抑制剂 同源模建 突变体 CO差光谱法 结合光谱法 结合常数 构效关系
分类号: S436.66
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 112次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


柑桔青霉病（Penicillium italicum Wehmer）和绿霉病（Penicillium digitatum Sacc）是柑桔果实在贮运期发生最严重的病害。目前农业上广泛使用的甾醇生物合成抑制剂（sterolbiosynthesis inhibitors,SBIs）类杀菌剂主要为14α-脱甲基酶抑制剂（14α-demethylation inhibitors,DMIs）。羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51,P45014DM)是唯一广泛存在于细菌、真菌、植物和动物中的细胞色素P450家族成员,它被视为最古老的细胞色素P450家族成员,是氮唑类抗真菌药物作用靶标酶。CYP51是真菌细胞膜麦角甾醇生物合成过程中的一个关键酶,它催化甾醇的14α-去甲基化反应。抑制真菌甾醇14α-去甲基化酶将会阻碍真菌麦角甾醇的合成,而麦角甾醇是真菌细胞膜基本成份,它的缺乏将导致膜结构的破坏和功能消失,最终导致真菌死亡。目前农业上DMIs类杀菌剂即是通过抑制真菌甾醇14α-去甲基化酶而发挥杀菌抑菌的作用。本研究以我国南方重要经济作物柑桔的病原菌绿霉菌（P.digitatum Sacc）为实验材料,采用基因工程技术克隆了柑桔绿霉菌CYP51基因,进行了高效表达和功能研究。同时,建立了柑桔绿霉菌CYP51蛋白的三维空间结构模型,并利用结合光谱法对有机小分子化合物的活性进行了筛选。本文主要得到以下结果:1.从柑桔绿霉菌（P.digitatum Sacc）中克隆了氮唑类杀真菌剂的靶标酶CYP51（PdCYP51）。该基因与文献中报道的柑桔绿霉菌CYP51基因（No.AB030178）相比有四个核苷酸不同,分别为C1370→T,A1604→G,G1648→A和G1768→T,该基因序列已提交Genbank（登记号为DQ355161）。这四个不同的核苷酸相应地导致四个氨基酸的不同,分别是P345→L,E423→G,G438→R和V478→L。该基因编码的蛋白质由516个氨基酸组成,同源比对结果表明,该蛋白与柑桔绿霉菌PD5（BAB03658,Pd2）同源性为99%,与意大利青霉P450-14DM（Q12664,Pi）蛋白同源性为86%,与烟曲霉Aspergillus fumigatus（AAF32372,Af）和费希新萨托菌Neosartorya fischeri（XP001267338,Nf）同源性为67%,含有CYP51家族蛋白的特征保守域SRS1（YxxF/LxxPxFGxxVxF/YD/a）和SRS4（GO/nht/sS）及P450家族保守域HBR（FxxGxxxCxG）。序列分析表明四个突变氨基酸位于PdCYP51的保守结构域之外,生测结果表明这四个突变氨基酸与该菌的抗性相关性不大。2.以结核分枝杆菌CYP51（Mycobacterium tuberculosis,MTCYP51）晶体结构为模板,利用SYBYL7.0软件包中的FUGUE模块成功地构建了柑桔绿霉菌CYP51蛋白的三维空间结构模型,PdCYP51蛋白三维空间模型与MTCYP51蛋白晶体结合叠合结果显示PdCYP51血红素辅基附近氨基酸具有很好重叠性。CYP51是一类跨膜蛋白,在真菌的麦角甾醇生物合成过程中起着非常重要的作的用。对其跨膜区分析表明,PdCYP51N端66个氨基酸跨膜两次。构建了重组表达质粒pET-PdCYP51并转化大肠杆菌,37℃下1mM IPTG诱导表达,得到了59kDa的特异性蛋白。超声破碎实验表明该重组蛋白主要以包涵体形式存在。重组蛋白经纯化浓缩后,注射家兔制得多克隆抗体。Western blot证明成功地制备了多克隆抗体,与表达的目的蛋白有特异性单一杂交带。优化pET-PdCYP51表达条件发现:在Rosetta（DE3）菌株中,30℃经1mM IPTG诱导获得了可溶性重组蛋白。根据柑桔绿霉菌CYP51跨膜结构的分析和三维空间结构的分析,重新构建了下列突变体,分别命名为pET-PdCYP51-18、pET-PdCYP51-66、pET-PdCYP51-244和p6P-PdCYP51-244,并在大肠杆菌中进行了表达。对pET-PdCYP51-18表达条件进行了优化,使其蛋白以可溶形式表达。同时构建了重组真核表达质粒pAUR-PdCYP51、p9K-PdCYP51和p9K-PdCYP51-244。3.根据CO差光谱法测定在Rosetta（DE3）中表达的PdCYP51重组蛋白活性。以柑桔绿霉菌微粒体和Rosetta（DE3）中表达的PdCYP51重组蛋白为材料,分析了商品化的烯唑醇、戊唑醇、三唑醇和三唑酮为代表的DMIs类杀真菌剂与CYP51的结合能力,分析了靶标酶活性、靶标酶纯度和靶标酶浓度对二者结合光谱的影响。结果表明,靶标酶活性和浓度是获得准确结合光谱的必要条件。根据米氏方程计算结合常数,计算得到烯唑醇、戊唑醇、三唑醇、三唑酮与靶标酶结合常数（Kd）,分别为0.12μM、0.32μM、0.64μM和0.99μM。该结果与其对柑桔绿霉菌生长抑制率EC50显著相关,证明结合光谱与生物活性测定相结合的方法可作为一种简便可靠的DMIs类杀真菌剂筛选方法。4.利用建立的结合光谱法对合成的不同结构类型的化合物（XF系列、WJ系列和ZST系列）进行了结合光谱测定,结合生物测定的结果筛选出了一批结合能力强和杀菌效果好的新型抗真菌化合物。这些化合物均为含氮化合物,并且在直链的不同位置、咪唑环或三唑环上以卤素原子来取代。在XF系列化合物中,XF-22、XF50、XF-78、XF-100、XF-113、XF118和XF169与PdCYP51和PdCYP51-18的结合能力较强,同时生物活性测定效果较好。在WJ系列的化合物中,WJ7、WJ10、WJ11、WJ12、WJ15、WJ21、WJ22、WJ25和WJ26与PdCYP51的结合能力较强,结合常数均小于0.2μM;对柑桔绿霉菌的抑制率均为100%,有些化合物甚至在25mg/ml的浓度时其抑菌率仍在80%以上。ZST系列中的ZST1、ZST5和ZST9与PdCYP51的结合能力较强,抑制率与结合常数一致。5.利用计算机辅助设计手段（采用FLexX软件）将含氮的新型有机化合物与PdCYP51的活性中心卟啉基上的铁离子对接,通过模拟计算得知含氮化合物与PdCYP51活性中心最大的作用距离为3（?）,为设计高效、专一性强的新型抗真菌化合物提供了一种有效的手段。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章 前言  14-44
  1.1 细胞色素P450研究进展  14-19
    1.1.1 细胞色素P450概述  14-15
    1.1.2 细胞色素P450多样性  15-17
    1.1.3 真菌细胞色素P450研究概况  17-19
  1.2 CYP51——甾醇14α-去甲基化酶  19-30
    1.2.1 CYP51家族研究概况  19-20
    1.2.2 CYP51的功能及调节作用  20-24
    1.2.3 CYP51活性分析  24-26
    1.2.4 CYP51结构解析  26-30
  1.3 抗真菌剂研究进展  30-39
    1.3.1 抗真菌剂种类及其作用机制  30-31
    1.3.2 病原真菌对SBIs杀菌剂的抗性机理  31-35
    1.3.3 氮唑类杀真菌剂研究进展  35-38
    1.3.4 DMIs药物作用靶标酶CYP51的方法学研究  38-39
  1.4 细胞色素P450基因的异源表达  39-42
  1.5 立题依据及研究意义  42-44
第二章 柑桔绿霉菌CYP51克隆表达和多克隆抗体的制备  44-63
  2.1 引言  44-45
  2.2 实验材料  45-47
    2.2.1 菌种和质粒  45
    2.2.2 化学试剂和抗菌素  45
    2.2.3 工具酶  45
    2.2.4 常用储存液  45
    2.2.5 常用缓冲液  45-46
    2.2.6 Ni-NTA亲和层析用缓冲液  46
    2.2.7 ELISA用缓冲液  46-47
    2.2.8 Western blot用缓冲液  47
    2.2.9 Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱  47
    2.2.10 常用培养基  47
  2.3 实验方法  47-54
    2.3.1 真菌DNA的提——CTAB法  47-48
    2.3.2 真菌RNA的提取——Trizol法  48
    2.3.3 柑桔绿霉菌CYP51基因特异性引物的设计  48
    2.3.4 RT-PCR  48-49
    2.3.5 基因序列分析  49
    2.3.6 重组载体构建  49-51
    2.3.7 重组蛋白的原核表达  51
    2.3.8 Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白质  51-52
    2.3.9 重组蛋白的透析、浓缩和定量  52
    2.3.10 多克隆抗体的制备及效价测定  52-53
    2.3.11 Western blot分析  53-54
  2.4 结果与分析  54-62
    2.4.1 柑桔绿霉菌PdCYP51基因克隆  54-55
    2.4.2 柑桔绿霉菌CYP51 cDNA测序分析  55-56
    2.4.3 PdCYP51基因分析  56-59
    2.4.4 重组表达质粒pET-PdCYP51的构建及在大肠杆菌中的表达  59-60
    2.4.5 重组柑桔绿霉菌CYP51蛋白的分离纯化  60-61
    2.4.6 多克隆抗体的制备和免疫学活性鉴定  61-62
  2.5 讨论  62-63
第三章 PdCYP51结构分析、突变体构建及表达条件的优化  63-84
  3.1 引言  63-64
  3.2 实验材料  64-65
  3.3 实验方法  65-67
    3.3.1 柑桔绿霉菌CYP51突变体特异性引物的设计  65
    3.3.2 PCR  65
    3.3.3 基因序列分析  65
    3.3.4 同源模建  65
    3.3.5 重组载体构建  65-66
    3.3.6 重组蛋白原核表达条件的优化  66
    3.3.7 Ni-NTA亲和层析柱分离纯化目的蛋白质  66
    3.3.8 重组蛋白的透析、浓缩和定量  66
    3.3.9 酵母转化  66-67
  3.4 结果与分析  67-82
    3.4.1 PdCYP51蛋白疏水性分析  67
    3.4.2 PdCYP51蛋白结构预测  67-69
    3.4.3 重组表达质粒pET-PdCYP512表达条件的优化和纯化  69-73
    3.4.4 PdCYP51跨膜结构分析  73-74
    3.4.5 PdCYP51突变体的同源模建  74
    3.4.6 PdCYP51-18突变体的构建及表达  74-76
    3.4.7 PdCYP51-66和PdCYP51-244突变体的构建及表达  76-79
    3.4.8 PdCYP51酵母表达载体的构建及转化  79-82
  3.5 讨论  82-84
第四章 DMIs杀菌剂活性筛选方法的建立、应用及分子对接  84-108
  4.1 引言  84-85
  4.2 材料和方法  85-88
    4.2.1 实验材料  85
    4.2.2 药物对柑桔绿霉菌生长抑制的测试  85-86
    4.2.3 柑桔绿霉菌微粒体的制备  86
    4.2.4 PdCYP51重组蛋白的制备和蛋白浓度测定  86
    4.2.5 重组蛋白PdCYP51含量测定及活性测定(CO差光谱)  86-87
    4.2.6 药物和靶标酶结合光谱分析  87
    4.2.7 分子对接模型的建立  87-88
  4.3 结果与分析  88-106
    4.3.1 杀真菌剂对柑桔绿霉菌生长抑制作用  88
    4.3.2 重组蛋白PdCYP51及突变体的性质研究  88-89
    4.3.3 PdCYP51蛋白结合光谱的建立  89-92
    4.3.4 标准杀真菌剂的光谱分析结果及与抑制率的相关性  92-94
    4.3.5 分子对接  94-95
    4.3.6 结合光谱法在筛选新农药中的应用  95-106
  4.4 讨论  106-108
第五章 结论  108-111
参考文献  111-126
附录1 XF系列化合物与PdCYP51-18结合光谱  126-131
附录2 WJ系列化合物与PdCYP51结合光谱  131-138
附录3 ZST系列化合物与PdCYP51结合光谱  138-142
缩略表  142-143
博士期间发表和待发表论文  143-144
致谢  144

相似论文

  1. 多转录因子组合调控研究,Q78
  2. 高校艺术教学建筑设计研究,TU244.3
  3. 时间表达式识别与归一化研究,TP391.1
  4. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  5. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  6. 拟南芥热激因子HSFA1d响应甲醛胁迫的作用研究,Q945.78
  7. hBMP4和hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究,Q78
  8. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  9. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  10. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  11. Pin1在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞周期的影响,R738.1
  12. BMP通路关键因子在人类牙胚组织中的表达检测,R78
  13. 《庄子》修辞策略探析,B223.5
  14. Gsα的过表达和缺失对果蝇大脑发育的影响,Q75
  15. 基于RNA测序技术的马氏珠母贝珍珠囊转录组及数字基因表达谱分析,Q786
  16. 磷酸化介导的UGT1A3代谢活性差异的初步研究,R346
  17. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  18. 鬼臼毒素衍生物的设计、合成及抗肿瘤活性研究,R284
  19. 稳定表达人有机阴离子转运多肽OATP1B1野生型及其突变体的HEK-293细胞系的构建,R96
  20. 论语文教师教学表达力,G633.3
  21. 条纹斑竹鲨和鲫鱼BAFF基因的克隆和性质分析,S917.4

中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 柑桔类病虫害
© 2012 www.xueweilunwen.com