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重组柑桔绿霉菌CYP51及其突变体与杀真菌剂结合光谱测定分析

作　者: 张劼
导　师: 刘德立
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 柑桔绿霉菌甾醇14α-去甲基化酶 14α-去甲基化酶抑制剂结合光谱分子对接
分类号: S436.66
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

柑桔绿霉菌是引起柑桔病害的重要病原真菌之一,可引发柑桔绿霉病,导致柑桔大量腐烂,给生产和生活造成巨大损失。烯唑醇和三唑酮是两种最为典型的三唑类杀真菌剂。它们具有很多优点,比如同时具有保护和防治的效果、只需使用很少的剂量就可以起到较长时期的防治效果等。正是由于它们的优点较为明显,烯唑醇和三唑酮被广泛的使用在柑桔贮藏期病害防治中。烯唑醇和三唑酮都是14α-脱甲基酶抑制剂即DMIs。它们的作用原理是通过作用于CYP51,使细胞膜的组成成分麦角甾醇合成受阻,破坏细胞膜的结构,最终达到抑制真菌的生长和杀死真菌的目的。虽然三唑类杀真菌剂的优点非常突出,但是由于长时间和大范围的使用,它也逐渐暴露出很多问题。它的作用位点较为专一,长时间的使用使得抗药性问题日益严重。近几年环境问题日趋严重,农业中的真菌病害发病率也迅速增加。2008年我国四川省就发生了大范围的柑桔病害,还波及到了周围的省份。人们不断的使用DMIs,但是效果却越来越有限主要原因就是抗药菌株的大量出现。面对这种现状,迫切需要开发新一代的高效、低毒、专一性强的杀真菌剂。在以往的研究中,杀真菌剂的开发主要通过对已有杀真菌剂的结构进行改造和修饰,这种方法往往具有随机性和盲目性。合成大量的化合物进行生物筛选,不但增加了工作量,也浪费了很多研究资源,不符合今后科研的总方向。人们一直在努力寻找更加省时省力的研究思路。本文研究了三类新型含氮化合物的离体抑菌活性及与异源表达的重组CYP51的结合能力。并根据生物信息学及分子对接结果,构建了不同的CYP51突变体。分析其与杀真菌剂的结合能力,进一步探讨其构效关系。研究结果如下:1.以原核表达的重组柑桔绿霉菌CYP51为材料,分析了其与商品化DMIs杀真菌剂烯唑醇、三唑酮及四种Q系列化合物的结合能力,并测定了这些化合物的离体抑菌活性。杀真菌剂通过与蛋白作用抑制真菌生长,其与蛋白的结合能力能够在一定程度上反映其抑菌能力,所以采用离体抑菌活性测定与结合光谱相结合的方法结果更加准确。应用结合光谱法对C系列、Z系列和Q系列化合物进行了结合光谱测定,结合生物测定结果,筛选出了一批兼具结合能力强和杀菌效果好的化合物。分别为C系列中的C-3、C-5和C-12;Z系列中的Z-5;Q系列中Q-6、Q-9和Q-10。尤其是Q-6、Q-9和Q-10与已商品化的三唑酮比较,其效果相当或更好,更具开发潜力。2.根据生物信息学分析及分子对接结果,构建了两种CYP51突变体,即去掉跨膜区及及仅含活性中心的突变体,分别实现了它们在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达。分析柑桔绿霉菌CYP51突变体与杀真菌剂的结合能力,结果表明全蛋白和去掉跨膜区的蛋白与C系列化合物的结合常数非常接近,酶的活性被很好的保留下来,符合柑桔绿霉菌CYP51全长及CYP51Pd-18突变体蛋白的三维结构模型对比的结果。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章前言  10-21
  1.1 P450研究现状  10-14
    1.1.1 概述及命名  10-11
    1.1.2 特性  11-12
    1.1.3 真菌P450研究现状  12-14
  1.2 CYP51研究意义与进展  14-16
    1.2.1 概述  14
    1.2.2 功能  14-15
    1.2.4 结构  15-16
  1.3 CYP51杀真菌剂研究进展  16-19
    1.3.1 种类及杀菌原理  16-17
    1.3.2 DMIs对CYP51作用的研究方法  17-18
    1.3.3 计算机手段在杀菌剂开发中的应用  18-19
  1.4 本文的研究目的、内容及意义  19-21
第二章柑桔绿霉菌CYP51与杀真菌剂结合光谱法的建立及应用  21-41
  2.1 实验材料  21
    2.1.1 菌种和质粒  21
    2.1.2 药物和试剂  21
    2.1.3 培养基及仪器  21
    2.1.4 主要的缓冲液  21
  2.2 实验方法  21-22
    2.2.1 不同化合物对柑桔绿霉菌的抑制活性测定  21-22
    2.2.2 异源表达重组柑桔绿霉菌CYP51蛋白的制备  22
    2.2.3 蛋白含量测定  22
    2.2.4 CYP51含量及活性测定(CO差光谱)  22
    2.2.5 化合物作用下异源表达柑桔绿霉菌CYP51光谱学分析  22
  2.3 结果与分析  22-39
    2.3.1 重组CYP51性质研究  22-23
    2.3.2 化合物对柑桔绿霉菌生长的抑制作用  23-24
    2.3.3 CYP51与杀真菌剂结合光谱法的建立  24-27
    2.3.4 含氮化合物的筛选及分子特征分析  27-39
  2.4 讨论  39-41
第三章柑桔绿霉菌CYP51突变体构建及其与杀菌剂结合特点分析  41-58
  3.1 实验材料  41
    3.1.1 菌种和质粒  41
    3.1.2 化学试剂及抗菌素  41
    3.1.3 工具酶  41
    3.1.4 缓冲液  41
    3.1.5 培养基  41
  3.2 实验方法  41-42
    3.2.1 生物信息学分析  41
    3.2.2 突变体引物设计  41-42
    3.2.3 突变体的构建  42
    3.2.4 突变体原核表达分析  42
    3.2.5 蛋白含量测定  42
    3.2.6 突变体与化合物结合光谱分析  42
    3.2.7 毕赤酵母GS115表达  42
  3.3 结果与分析  42-54
    3.3.1 生物信息学分析  42-46
    3.3.2 突变体的构建  46-49
    3.3.3 突变体的表达  49-50
    3.3.4 不同突变体蛋白与C系列化合物的结合光谱  50-54
  3.4 讨论  54-58
参考文献  58-65
硕士期间发表论文  65
衷心感谢以下基金资助  65-66
致谢  66

重组柑桔绿霉菌CYP51及其突变体与杀真菌剂结合光谱测定分析

内容摘要

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