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乙酰肝素酶在卵巢上皮癌浸润转移过程中的生物学作用机理研究

作　者: 陈泓
导　师: 唐步坚；李力
学　校: 广西医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 乙酰肝素酶 卵巢癌 真核表达载体 转染 细胞功能 RNAi shRNA表达载体 慢病毒载体 表达
分类号: R737.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


卵巢上皮癌是妇科恶性肿瘤中发病率占第三位,死亡率却居第一的恶性疾病。由于卵巢解剖上隐匿于盆腔深处,在发病早期缺乏特异性症状和体征,很难在早期发现和诊断,约60%-70%的卵巢癌患者确诊时己属于晚期。近30年来,虽然经过全世界妇科肿瘤专家的不懈努力,不断改进手术方式,发现更新更好的化疗药物,增加新的化疗方案,但是5年生存率一直徘徊在20%-30%左右。所以,寻找新的诊断方法和新的治疗手段是目前卵巢癌研究的重点。作为一种与粘附和渗出等肿瘤浸润转移必须过程密切相关的物质,乙酰肝素酶(HPSE)在卵巢癌的浸润转移中起着举足轻重的作用。本课题通过一系列体外实验,对HPSE在卵巢癌浸润转移过程中的作用及其机制做了深入的研究,并且构建了HPSE基因慢病毒表达和RNAi载体,为今后的基因靶向治疗奠定了基础。乙酰肝素酶基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建目的:通过基因工程技术,扩增出乙酰肝素酶基因全长,构建其真核载体。为进一步研究乙酰肝素酶与卵巢癌浸润转移的关系打下基础。方法:选取浆液性卵巢癌组织作为模板提取人卵巢癌组织总mRNA,RT-PCR技术扩增cDNA,利用PCR技术进行乙酰肝素酶基因全长的扩增。将其与真核表达载体pcDNA3.1连接,进行克隆及酶切和测序鉴定。结果:成功扩增出目的基因全长,并经测序验证其同源性达100%。结论:成功从恶性卵巢癌组织中扩增出HPSE全长并构建了其真核表达载体。乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究目的:了解乙酰肝素酶对卵巢癌细胞功能的影响,分析HPSE在卵巢癌浸润转移过程中所起的作用;探索其作为早期诊断、治疗靶向的价值。方法:成功构建HPSE基因真核表达载体后,将其转染无HPSE基因表达的卵巢癌细胞株A2780,G418筛选后经RT-PCR及western-blot鉴定确认获得稳定转染的HPSE/A2780细胞株。然后进行细胞生长特性、细胞周期变化、黏附能力、细胞侵袭转移能力的实验。结果:通过转染筛选,获得能够稳定表达HPSE蛋白的卵巢癌细胞株。流式细胞仪对细胞检测结果显示A2780-HPSE组处于增殖状态(S+G2+M)的细胞为46.5%,G1期为53.5%,对照组则相应为54.5%和45.6%,其处于增殖周期的细胞有减少的趋势。HPSE组和对照组的生长曲线几近重合。两组的克隆形成率差异无统计学意义。A2780细胞在转染前后粘附率分别为0.5183±0.0796和0.7283±0.08931,比较有统计学意义(p=0.002)。Transwell小室实验发现转染HPSE基因后的A2780细胞的侵袭能力明显提高,与对照组比较有统计学意义(p=0.003)。而其迁移能力未受影响(p=0.618)。结论:细胞功能实验结果表明,HPSE能够增强卵巢癌A2780细胞的侵袭能力,降低其黏附能力;对增殖能力和迁移能力均无影响。RNAi阻断乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外体实验研究目的:通过构建人乙酰肝素酶(HPSE)基因的shRNA表达载体,转染卵巢癌细胞,检测其对HPSE基因的干扰效率。继而筛选出稳定干扰的细胞株,进行一系列功能实验,反面验证HPSE基因的功能。方法:针对HPSE mRNA的不同区域构建不同的shRNA表达载体,脂质体法转染HPSE高表达的人卵巢癌细胞系SKOV3,实时定量PCR检验干扰效率,选择抑制率最高的一组细胞进行抗性筛选,获得稳转细胞株,western-blot检验HPSE蛋白受抑制情况,然后进行细胞功能实验。结果:用荧光定量PCR对不同shRNA干扰载体的干扰效果进行检测结果显示,pGPU6/GFP/Neo-HPSE-1222组相对拷贝数为0.936±0.417,与其他3组相比有统计学意义,抑制率为48.63%。获得的该组稳定干扰表达株western-blot检验其HPSE蛋白表达明显减少。细胞生长曲线显示干扰组细胞倍增时间延长。干扰组与对照组集落形成率分别为0.0433±0.0451和0.0397±0.00687,p=0.059,比较无统计学意义。侵袭能力实验中,干扰组吸光值为0.5697±0.106,对照组为0.8097±0.333,干扰组与对照组相比无统计学意义(p=0.233)。细胞粘附能力检测,干扰组0.7533±0.07685,对照组0.5833±0.11994,两者相比有统计学意义(p=0.015)。侵袭能力实验干扰组为0.69±0.085,对照组为1.091±0.277,两者相比有统计学意义(p=0.015)。结论:采用构建shRNA干扰载体对HPSE基因进行干扰,有效地抑制了HPSE基因的活性,使卵巢癌细胞侵袭和黏附能力降低。HPSE重组慢病毒转基因系统和重组慢病毒干扰系统的构建目的:采用第二代和第三代慢病毒载体,分别构建HPSE基因的慢病毒表达载体和shRNA慢病毒干扰载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法:首先扩增HPSE全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序BLAST检索,并将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48小时后提取mRNA,RT-PCR检验HPSE基因表达情况。其次,选取干扰效果最佳的siRNA,设计shRNA结构,退火反应形成双链后与慢病毒载体pSico连接并送测序。结果:重组慢病毒质粒HPSE-pWPI测序结果经BLAST,与HPSE基因的同源性达99%。转染293T后有HPSE基因的表达。重组慢病毒干扰载体pSico/HPSE测序结果与设计的shRNA序列完全一致。结论:成功的构建了HPSE基因的重组慢病毒系统和慢病毒干扰系统。为今后的HPSE靶向治疗奠定了基础。

全文目录


致谢  16-17
英文缩略词  17-20
中文摘要  20-23
英文摘要  23-27
第一章 卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断治疗进展(文献综述)  27-101
  1.卵巢恶性肿瘤浸润转移的主要步骤  27-32
    1.1 原发恶性肿瘤的浸润  27-30
      1.1.1 细胞的转化和肿瘤细胞的增殖  27-28
      1.1.2 肿瘤细胞的分离  28
      1.1.3 粘附并破坏细胞外基质和基底膜  28-29
      1.1.4 肿瘤细胞运动  29-30
    1.2.恶性肿瘤细胞的迁移  30
      1.2.1 恶性肿瘤细胞粘附到脉管基底膜  30
      1.2.2 穿过脉管壁进入循环系统  30
    1.3 恶性肿瘤细胞的转移  30-32
      1.3.1 逃脱免疫监视在循环系统中生长  30-31
      1.3.2 锚定粘附并破坏脉管壁  31-32
        1.3.2.1 锚定粘附  31
        1.3.2.2 肿瘤细胞逸出循环系统  31-32
      1.3.3 转移灶的形成  32
      1.3.4 转移的休眠  32
      1.3.5 肿瘤转移的器官选择性  32
  2 卵巢恶性肿瘤浸润转移的主要途径  32-35
    2.1 腹腔种植  32-33
    2.2 淋巴转移  33-34
      2.2.1 卵巢的淋巴系统  33
      2.2.2 恶性卵巢肿瘤的淋巴转移机制  33
      2.2.3 卵巢恶性肿瘤的淋巴转移规律  33-34
    2.3 影响卵巢肿瘤淋巴结转移的相关因素  34-35
      2.3.1 临床期别  34
      2.3.2 病理分型  34
      2.3.3 细胞分化程度  34
      2.3.4 原发病灶大小  34-35
      2.3.5 腹水性状  35
  3 卵巢恶性肿瘤浸润转移主要分子机理  35-52
    3.1 基因调控与卵巢恶性肿瘤的浸润转移  35-39
      3.1.1 肿瘤转移基因  35-36
      3.1.2 肿瘤转移抑制基因  36-39
    3.2 黏附因子与卵巢恶性肿瘤的浸润转移  39-45
      3.2.1 钙粘蛋白家族  39-41
      3.2.2 整合素  41-42
      3.2.3 免疫球蛋白超家族  42-43
      3.2.4 选择素家族  43-44
      3.2.5 CD44  44-45
    3.3 血管的生成与卵巢恶性肿瘤的浸润转移  45-47
      3.3.1 血管内皮生长因子  46-47
      3.3.2 碱性成纤维细胞生长因子  47
    3.4 蛋白溶解酶与卵巢恶性肿瘤  47-52
      3.4.1 基质金属蛋白酶  48-49
      3.4.2 纤维蛋白溶解酶及其调节因子  49-50
      3.4.3 组织蛋白酶  50-52
      3.4.4 乙酰肝素酶  52
  4 卵巢恶性肿瘤浸润转移的临床表现及特点  52-54
    4.1 盆、腹腔种植转移  52-54
      4.1.1 子宫及附件  53
      4.1.2 腹膜  53
      4.1.3 肠道  53
      4.1.4 肝、脾  53
      4.1.5 大网膜  53-54
    4.2 淋巴结转移  54
  5 卵巢恶性肿瘤浸润转移的物理诊断  54-58
    5.1 超声检查在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值  54-55
    5.2 CT在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值  55-56
    5.3 MRI在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值  56-57
    5.4 PET-CT在卵巢恶性肿瘤浸润转移诊断中的价值  57-58
      5.4.1 PET-CT的原理  57
      5.4.2 PET-CT与卵巢恶性肿瘤浸润转移的诊断  57-58
  6 卵巢恶性肿瘤浸润转移的分子诊断  58-63
    6.1 卵巢恶性肿瘤浸润转移的基因诊断  58-60
      6.1.1 C-erbB-2  59
      6.1.2 nm23基因  59-60
      6.1.3 p53基因  60
    6.2 肿瘤标志物  60-63
      6.2.1 肿瘤相关抗原  61-62
      6.2.2 激肽释放酶家族  62-63
  7 卵巢恶性肿瘤浸润转移的治疗  63-90
    7.1 手术  63-74
      7.1.1 原发卵巢恶性肿瘤FIGO分期  63-65
      7.1.2 术后残余灶与预后的关系  65
      7.1.3 大网膜切除术在卵巢癌治疗中的价值  65-66
        7.1.3.1 卵巢癌大网膜转移的发生率  65
        7.1.3.2 卵巢癌大王膜切除与预后的关系  65-66
        7.1.3.3 大网膜切除范围  66
      7.1.4 腹后腔淋巴结清扫在卵巢癌治疗中的价值  66-68
        7.1.4.1 卵巢癌腹后腔淋巴结转移率  66
        7.1.4.2 卵巢癌腹后腔淋巴结转移与预后  66
        7.1.4.3 腹后腔淋巴结清扫的意义  66-68
      7.1.5 阑尾切除在卵巢癌治疗中的意义  68-70
        7.1.5.1 卵巢癌阑尾转移率  68-69
        7.1.5.2 卵巢癌阑尾切除与预后  69-70
      7.1.6 脾等远处转移灶切除在卵巢癌治疗中的价值  70-74
        7.1.6.1 脾切除术  70-72
        7.1.6.2 横膈膜手术  72
        7.1.6.3 卵巢癌肠道转移瘤手术  72-74
    7.2 卵巢癌的化学治疗  74-82
      7.2.1 晚期卵巢癌化疗的适应症  74-76
        7.2.1.1 先期化疗  74-75
        7.2.1.2 术后化疗  75
        7.2.1.3 腹腔化疗  75-76
      7.2.2 化疗药物、方案及途径  76-82
        7.2.2.1 化疗药物  76-79
        7.2.2.2 化疗方案及给药途径  79-82
    7.3 晚期卵巢癌化疗前瞻性多中心随机的临床验证  82-83
      7.3.1 铂类+紫杉醇  82-83
      7.3.2 多西紫杉醇与紫杉醇  83
      7.3.3 表柔比星  83
      7.3.4 拓扑替肯  83
    7.4 晚期卵巢癌的靶向治疗  83-90
      7.4.1 抗体介导的靶向治疗  84-85
      7.4.2 信号传导通路抑制剂  85
      7.4.3 酪氨酸激酶抑制剂  85-86
      7.4.4 抗血管生成药物  86-87
      7.4.5 基因治疗  87-89
        7.4.5.1 多重耐药基因  87-88
        7.4.5.2 启动子  88
        7.4.5.3 抑癌基因  88-89
        7.4.5.4 分子化疗  89
      7.4.6 光动力学治疗  89-90
  8 乙酰肝素酶在恶性肿瘤浸润转移中的作用  90-97
    8.1 乙酰肝素酶的分子结构  91-92
      8.1.1 HPSE基因结构及定位  91-92
      8.1.2 HPSE蛋白质结构  92
    8.2 乙酰肝素酶的主要生物学作用  92-93
      8.2.1 细胞外基质的结构  92-93
      8.2.2 HPSE的生物学功能  93
    8.3 乙酰肝素酶的分子调节机制  93-95
      8.3.1 细胞因子调节  94
      8.3.2 启动子去甲基化  94
      8.3.3 转录因子调控  94
      8.3.4 微环境的PH值  94-95
      8.3.5 HSPG内化调控  95
      8.3.6 激素  95
    8.4 乙酰肝素酶在恶性肿瘤浸润转移中的生物学作用  95-97
      8.4.1 HPSE在各种恶性肿瘤的表达情况  95-96
      8.4.2 HPSE在肿瘤浸润转移中的作用  96-97
  9 乙酰肝素酶在卵巢癌浸润转移中的作用机理  97-99
    9.1 HPSE在卵巢癌中的表达  97-98
    9.2 HPSE表达与卵巢癌组织学类型和组织分化的关系  98
    9.3 HPSE在卵巢癌浸润转移中可能的作用机理  98-99
      9.3.1 HPSE降解细胞外基质  98-99
      9.3.2 HPSE促进卵巢癌血管生成  99
  10 本研究的目的和意义  99-101
第二章 乙酰肝素酶基因全长扩增和真核表达载体的构建  101-127
  1 材料与方法  101-115
    1.1 材料  101-105
      1.1.1 标本  101
      1.1.2 质粒与菌株  101-102
      1.1.3 主要试剂及配制  102-104
        1.1.3.1 试剂  102-104
        1.1.3.2 试剂的配制  104
      1.1.4 仪器  104
      1.1.5 器具的处理  104-105
    1.2 引物的设计与合成  105
      1.2.1 HPSE引物  105
      1.2.2 内参基因β-actin引物  105
    1.3 实验方法  105-115
      1.3.1 卵巢癌组织总RNA的提取  105-106
      1.3.2 cDNA第一链的合成  106-108
      1.3.3 HPSE全长扩增  108-109
      1.3.4 PCR产物的纯化与回收  109-110
      1.3.5 感受态大肠杆菌的制备  110
      1.3.6 PCR产物的酶切反应及回收  110-111
      1.3.7 质粒的制备  111-112
      1.3.8 目的基因与载体的连接  112
      1.3.9 连接产物转化感受态大肠杆菌  112-113
      1.3.10 挑选阳性克隆  113
      1.3.11 质粒的快速提取  113-114
      1.3.12 PCR鉴定  114
      1.3.13 重组质粒的双酶切鉴定  114
      1.3.14 重组质粒测序  114
      1.3.15 测序结果的序列分析  114-115
  2 结果  115-124
    2.1 卵巢癌组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果  115
    2.2 β-actin内参检测cDNAPCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果  115-116
    2.3 HPSE全长扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果  116
    2.4 HPSE全长PCR产物测序结果  116-120
    2.5 携带HPSE基因的pcDNA3.1与原质粒pcDNA3.1琼脂糖凝胶电泳结果  120
    2.6 重组质粒HPSE-pcDNA3.1的PCR鉴定及酶切鉴定结果  120-121
    2.7 携带HPSE基因的pcDNA.1测序结果  121-124
  3 讨论  124-127
    3.1 HPSE基因的结构特点及测序结果分析  124-125
    3.2 pcDNA3.1载体选择的意义  125-126
    3.3 HPSE-pcDNA3.1真核载体构建的意义  126-127
第三章 乙酰肝素酶介导的卵巢癌上皮细胞系浸润转移体外实验研究  127-153
  1 材料和方法  127-144
    1.1 材料  127-132
      1.1.1 质粒、菌株与细胞株  127-128
      1.1.2 主要试剂及配制  128-131
        1.1.2.1 试齐  128-129
        1.1.2.2 试剂的配制  129-131
      1.1.3 仪器  131-132
    1.3 实验方法  132-144
      1.3.1 转染细胞系的选择  132
      1.3.2 脂质体介导的HPSE-pcDNA3.1质粒的转染  132-134
      1.3.3 携带HPSE基因的A2780细胞的筛选  134-135
      1.3.4 携带HPSE基因的A2780细胞的克隆  135-136
      1.3.5 RT-PCR检测转染后A2780细胞的HPSEmRNA表达  136
      1.3.6 western-blot检测HPSE蛋白表达  136-139
      1.3.7 细胞生物学特性实验  139-143
        1.3.7.1 细胞生长曲线测定(MTT法)  139
        1.3.7.2 流式细胞仪检测细胞生长周期变化  139-140
        1.3.7.3 细胞集落形成实验  140
        1.3.7.4 细胞体外迁移能力测定  140-141
        1.3.7.5 细胞体外侵袭能力测定  141-143
        1.3.7.6 细胞体外黏附能力测定  143
      1.3.8 统计学方法  143-144
  2 结果  144-150
    2.1 不同种类卵巢癌细胞的HPSE基因表达情况  144
    2.2 转染条件的确定  144-145
    2.3 绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1阳性对照结果  145
    2.4 筛选A2780细胞的G418浓度的确定  145
    2.5 G418筛选结果  145-146
    2.6 筛选出的A2780细胞RT-PCR检测HPSE表达情况  146
    2.7 筛选出的A2780细胞western-blot检测HPSE蛋白表达结果  146-147
    2.8 筛选出的A2780细胞流式细胞仪检测细胞生长周期结果  147
    2.9 细胞集落形成实验结果  147-148
    2.10 筛选出的A2780细胞生长曲线结果  148
    2.11 细胞体外迁移能力的测定结果  148-149
    2.12 细胞体外侵袭能力测定结果  149-150
    2.13 细胞体外黏附能力测定结果  150
  3 讨论  150-153
第四章 RNAi阻断乙酰肝素酶介导的卵巢上皮癌细胞系浸润转移体外实验研究  153-176
  1 材料和方法  153-164
    1.1 材料  153-158
      1.1.1 质粒与菌株  153-155
      1.1.2 主要试剂及配制  155-156
      1.1.3 引物的设计与合成  156
      1.1.4 shRNA载体的设计与合成  156-158
    1.2 实验方法  158-164
      1.2.1 转染细胞系的选择  158
      1.2.2 脂质体介导的shRNA载体转染SKOV3细胞  158
      1.2.3 对HPSE沉默效果最佳的shRNA的筛选  158-163
        1.2.3.1 转染后SKOV3细胞总RNA提取  158
        1.2.3.2 SYBR GREE1实时定量PCR检测六种干扰载体转染SKOV3细胞后HPSE基因表达  158-163
      1.2.4 转染shRNA载体的SKOV3细胞的筛选  163
      1.2.5 筛选出的SKOV3细胞的克隆  163
      1.2.6 western-blot检测HPSE蛋白表达  163
      1.2.7 细胞生物学特性实验  163-164
        1.2.7.1 细胞生长曲线测定(MTT法)  163
        1.2.7.2 细胞集落形成实验  163
        1.2.7.3 细胞体外迁移能力测定  163
        1.2.7.4 细胞体外侵袭能力测定  163
        1.2.7.5 细胞体外黏附能力测定  163-164
  2 结果  164-173
    2.1 不同种类卵巢癌细胞的HPSE基因表达情况  164
    2.2 shRNA转染SKOV3细胞48小时后在荧光显微镜下结果  164-165
    2.3 构建好的GADPH-pTG-T质粒测序结果  165
    2.4 不同shRNA干扰载体对SKOV3细胞HPSE抑制效果的检测结果  165-166
    2.5 标准品QRT-PCR扩增标准曲线结果  166
    2.6 标准品测定的实时荧光扩增融解曲线结果  166-167
    2.7 转染不同shRNA载体后QRT-PCR检测HPSE基因表达情况结果  167-168
    2.8 转染不同shRNA载体后QRT-PCR检测HPSE基因表达的结果统计学分析结果  168-169
    2.9 转染后SKOV3细胞筛选后14天结果  169-170
    2.10 western-blot检测HPSE蛋白表达结果  170
    2.11 细胞生长曲线结果  170-171
    2.12 细胞集落形成实验结果  171
    2.13 细胞体外迁移能力的测定结果  171-172
    2.14 细胞体外侵袭能力测定结果  172
    2.15 细胞体外黏附能力测定结果  172-173
  3 讨论  173-176
第五章 HPSE重组慢病毒转基因系统和重组慢病毒干扰系统的构建  176-195
  1 材料和方法  176-189
    1.1 材料  176-181
      1.1.1 质粒与菌株、细胞  176-180
      1.1.2 主要试剂  180-181
      1.1.3 仪器  181
    1.2 HPSE引物的的设计与合成  181-182
    1.3 实验方法  182-189
      1.3.1 HPSE慢病毒表达系统的构建  182-186
        1.3.1.1 HPSE全长的扩增  182
        1.3.1.2 PCR产物的纯化和回收  182-183
        1.3.1.3 SpeI酶切PCR产物及回收  183
        1.3.1.4 PCR产物磷酸化  183-184
        1.3.1.5 载体的准备  184-185
        1.3.1.6 HPSE与pWPI的连接  185
        1.3.1.7 连接产物转化大肠杆菌HB101_  185
        1.3.1.8 挑选阳性克隆  185-186
        1.3.1.9 质粒DNA的提取  186
        1.3.1.10 重组质粒的PCR鉴定  186
        1.3.1.11 重组质粒的测序  186
        1.3.1.12 测序结果分析  186
        1.3.1.13 HPSE-pWPI转染293T  186
        1.3.1.14 转染后mRNA提取并转录为cDNA  186
        1.3.1.15 HPSE-pWPI转染的293THPSE表达  186
      1.3.2 HPSE RNAi慢病毒载体的构建  186-189
        1.3.2.1 shRNA的设计  186-187
        1.3.2.2 插入片段的退火  187
        1.3.2.3 HpaI和XhoI双酶切pSico  187-188
        1.3.2.4 连接反应  188
        1.3.2.5 连接产物转化大肠杆菌  188
        1.3.2.6 挑选阳性克隆  188
        1.3.2.7 质粒DNA的提取  188
        1.3.2.8 重组质粒的测序  188-189
  2 结果  189-193
    2.1 HPSE全长扩增产物电泳结果  189
    2.2 HPSE和pWPI连接产物转化大肠杆菌后涂板生长结果  189-190
    2.3 阳性克隆提取的质粒电泳结果  190
    2.4 重组质粒PCR鉴定结果  190
    2.5 重组质粒的测序结果  190-191
    2.6 HPSE-pWPI转染293T结果  191-192
    2.7 HPSE-pWPI转染后HPSE表达结果  192
    2.8 RNAi重组质粒提取结果  192
    2.9 RNAi重组质粒测序结果  192-193
  3 讨论  193-195
全文小结  195-196
参考文献  196-217

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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